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1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Protocole détude du potentiel chondroprotecteur des eaux minérales in vitro Jean Cambar, Béatrice LAzou,

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1 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Protocole détude du potentiel chondroprotecteur des eaux minérales in vitro Jean Cambar, Béatrice LAzou, Christian Toussaint, Céline Ohayon Faculté de Pharmacie – EA 3672 Université Victor Segalen - Bordeaux 2, France

2 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Le contexte : le thermalisme et larthrose Orientation Rhumatologie : curistes (30% de la fréquentation) Arthrose : curistes (60% des curistes en RH) Avantages du thermalisme Baisse de la douleur Diminution de la consommation de médicaments Traitement non agressif Mécanismes daction ? Techniques thermales, prise en charge globale du patient.. Propriétés physiques et/ou chimiques des produits thermaux

3 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains La démarche générale de notre équipe Hypothèse : certains éléments minéraux connus pour leur tropisme pour les os et le cartilage, auraient des propriétés anti-arthrosiques. Approches envisagées Étude du passage transcutané des éléments contenus dans leau minérale et la boue thermale (cuivre, zinc, strontium, manganèse …) Recherche de lactivité in vitro de ces éléments sur des modèles cellulaires pertinents

4 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Passage transcutané Le passage transcutané déléments des eaux minérales a déjà été mis indirectement en évidence Par traceurs radioactifs (Dubarry, Tamarelle, ) Par mesure des niveaux sériques (Sukenik, 1992) Protocole de nos études antérieures Cellule de diffusion (Franz) sur peau humaine avec compartiment de recueil contenant du plasma humain Modalités expérimentales proches des pratiques thermales (applications répétées de boue ou deau) Dosage spectrométrique des éléments dans le plasma de recueil Aucun passage : fer, sodium, potassium, chlorure, calcium Passage : manganèse, strontium, zinc et cuivre

5 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Arthrose et modèles cellulaires in vitro Mécanismes de larthrose encore mal connus Principalement lié à un dysfonctionnement de la cellule constitutive du cartilage, le chondrocyte Déséquilibre entre les phénomènes danabolisme et de catabolisme du cartilage articulaire : le chondrocyte est anormalement stimulé et dysrégulé. Lutilisation de cultures cellulaires de chondrocytes représente un modèle détude pour mettre en évidence les modifications métaboliques survenant dans le cartilage.

6 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Intérêt des mod è les in vitro Contributions reconnues et déjà validées des modèles in vitro en pathologie et en thérapeutique. Déjà des références en thermalisme avec des modèles de fibroblastes, de cellules musculaires,.. Corrélations avec les études sériques de marqueurs de linflammation chez des patients arthrosiques;

7 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Présentation du projet Choix des éléments à tester : Sr et Mn Choix du modèle cellulaire : chondrocytes humains sains en primoculture Objectifs Valider le modèle cellulaire (amplification et différentiation) Déterminer la viabilité et la prolifération cellulaires en présence de Sr et de Mn (pour définir les doses et la durée dexposition) Caractériser certains marqueurs de la matrice extracellulaire Mesurer leffet du Sr et Mn sur la balance synthèse/dégradation des constituants de la MEC Étude retenue par lAFRETH pour un financement dune durée de 1 an

8 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Choix des éléments Le strontium cation bivalent avec une forte affinité pour los, effet bénéfique, soit sur la production de la MEC (stimule la production de protéoglycannes), soit par inhibition de la dégradation du cartilage dans larthrose, Le manganèse rôle dans la constitution denzymes et de métalloenzymes, optimise la production des glycosaminoglycannes et donc des protéoglycannes, Vérifier laction du strontium, du manganèse et de leur association sur cultures de chondrocytes humains

9 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Choix du modèle cellulaire Primoculture de cellules cartilagineuses humaines saines Disponibles dans le commerce Garanties pour Conservation du phénotype si 10° doublement de population Production de collagène II

10 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Objectif 1 : validation du modèle de culture Difficultés : maintenir les chondrocytes dans un état différencié stable tout en permettant la multiplication des cellules Plusieurs modèles de cultures testés Choix de primo- cultures de chondrocytes de veau

11 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Choix du modèle Matériel facilement disponible : primocultures de chondrocytes de veau ( A.M. Freyria, ibcp, Lyon ) 1° approche : culture organotypique, culture sur biomatériaux ou sur gel, culture en suspension Maintien du phénotype Faible production de cellules Méthodes complexes Incompatibles avec les tests réalisés 2° approche : culture en monocouche sur des surfaces spécifiques (laminine, collagène I) Multiplication des cellules Méthodes plus simples Phénotype instable LaminineCollagène IAc Coll. I Agarose 2%

12 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Choix du modèle 3° approche : culture en monocouche sur plastique Méthodes plus simples,compatibles avec nos études Augmentation du pouvoir prolifératif Phénotype variable selon lorigine des cellules (espèces, âge) et la densité cellulaire Faible densité Forte densité Approche retenue : culture en forte densité, en vérifiant le phénotype (méthodes immunochimiques et de biologie moléculaire)

13 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Objectif 2 : études de la viabilité Permettent de déterminer les doses de Sr et Mn non toxiques à utiliser et de quantifier un éventuel pouvoir prolifératif. Phase préliminaire sur lignée de cellules mésangiales humaines (IP15) Matériel cellulaire disponible au laboratoire en grande quantité (lignée stable) Matériel humain produisant de la matrice extracellulaire Phase de confirmation sur chondrocytes de veau

14 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Résultats de viabilité cellulaire (IP15) Méthodologie : Utilisation dun colorant vital (rouge neutre) Mesure de lintégrité membranaire (lysosomes) Évaluation du nombre de cellules vivantes 24 h 72 h

15 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Résultats de la prolifération cellulaire (IP15) Méthodologie : Utilisation dun colorant vital (rouge neutre) Mesure de lintégrité membranaire (lysosomes) Évaluation du nombre de cellules vivantes en fonction du temps

16 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Confirmation des résultats sur chondrocytes Le Sr et le Mn ninduisent aucune mort cellulaire, ni prolifération cellulaire, quelle que soit la dose utilisée. 72 h Choix des doses de létude Sr : 0,01 - 0,1 et 1 mg/ml Mn : et 100 µg/l Choix de la durée dexposition 72 h, 7 j et 21 j Compatibles avec les résultats des études du passage transcutané et les pratiques thermales

17 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Objectif 3 : marqueurs de la MEC Mise en évidence et quantification des constituants majoritaires de la MEC synthétisés par les chondrocytes (libérés dans le surnageant et/ou ancrés sur les cellules) Collagènes méthode biochimique colorimétrique (rouge de Sirius, kit Biocolor, Sircol) quantification de tous les collagènes solubles Protéoglycannes méthode biochimique colorimétrique (bleu de méthylène, kit Biocolor, Blyscan) quantification des glycosaminoglycannes sulfatés

18 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Résultats de létude des marqueurs de la MEC Niveau basal des GAGs (veau et homme) Niveau basal Collagène Niveau basal très élevé (biais méthodologique, présence de collagène dans le milieu de culture) Nécessité de mettre en œuvre la RT-PCR pour utiliser ce marqueur

19 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Objectif 4 : effet du Sr et Mn sur la MEC Cellules de chondrocytes de veau Pas de modification du niveau basal Pas daction cellulaire directe sur les marqueurs choisis Envisager dautres marqueurs comme les cytokines pro- inflammatoires (MMP, TIMPs) et les IL.

20 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Effet du Sr et Mn en présence dIL-1 Nécessité de mettre en œuvre une autre approche : effet potentiel de restauration en présence dagents catabolisants (IL-1) pour mimer les chondrocytes arthrosiques.

21 1° Symposium Thermal Européen - Aix-les-Bains Conclusion Cette étude réalisée in vitro sur chondrocytes permet de disposer dun modèle détude rapide de leffet des éléments minéraux contenus dans les produits thermaux, d'étudier leffet de ces éléments sur la production des constituants majoritaires de la matrice extracellulaire, dévaluer leur effet sur la balance synthèse/dégradation de la MEC Mais, il sera nécessaire de mettre en œuvre des moyens supplémentaires (de biologie moléculaire, dimmuno-histochimie et biochimiques) pour approfondir les mécanismes impliqués.


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