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Biologie moderne des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) C.Preudhomme Laboratoire dHématologie A U524 Inserm Lille.

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1 Biologie moderne des leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) C.Preudhomme Laboratoire dHématologie A U524 Inserm Lille

2 Introduction 40 % des LAM : Anomalies cytogénétiques Anomalies cytogénétiques Identification de gènes Pronostic Diagnostic et suivi Physiopathologie Modèle murin 60 % des LAM : Identification dautres mécanismes Identification dautres gènes (analogie de fonction ou nouvelles technologies) Ciblage thérapeutique moléculaire

3

4 2003 Impact pronostique des anomalies chromosomiques Consensus international –Bon risque t(15;17) t(8;21) inv(16) –Mauvais risque -5/5q- -7 3q t(9;22) t(6;9) complexe –Intermédiaire caryo normal Résultats contradictoires 11q23 trisomie 8 autres trisomies autres a.structure Reste à définir sur grandes séries prospectives

5 Distribution des anomalies chromosomiques varie avec l âge (St Jude -Schoch) <2 ansenfantsAdult <60 ansAdult >60 ans t(8;21) 0% 14% 8% 2% inv(16) 5% 6% 5% 3% t(15;17) 0% 8% 6% 3% 41%9% 5,3% t(9;11) 18% 6% 2% autres 11q23 23% 3% 3% 0,8% Normal 10% 20% 40% 40% Complex - < 10% 15% 30%

6 MRC10 t(8;21) t(15;17) inv(16) normal anomalies isolées associées à risque intermédiaire associées à mauvais risque

7 Caryotype complexe Définition variable MRC >=5 anomalies EORTC/GIMENA >=4 anomalies Autres groupes >=3 anomalies Basé sur résultats caryotype (cytogénétique conventionnelle) Fréquence augmente avec âge enfant <10% adulte 8-10% >60 ans 18-30%

8 Que contient un caryotype complexe ? Schoch GCC 2002;35:20 -5/5q- -7/7q- 17p- 18q-, 12p- … moins fréquents souvent combinées ( 24% : les 3 délétions) Pertes >>>> gains 15%-20% des cas : absence danomalie 5/ 7/ 17

9 Impact pronostique du caryotype complexe MRC ans MRC11 s.âgés MRC

10 German AML cooperative group retrouve le mauvais pronostic >=3 anomalies chez 60 ans Schoch BJH 2001; 112: 118

11 Les 11q23/MLL Distinction t(9;11)(p21;q23) et les autres 11q23/MLL St Jude JCO 2002; 20: 2302 LAM enfant

12 Les 11q23/MLL LAM adulte MRC MRC : tous 11q23/MLL dans groupe intermédiaire ASH2002: tous 11q23/MLL restent dans groupe intermédiaire CALGB t(9;11) dans groupe intermédiaire autres 11q23 dans groupe mauvais pronostic SWOG tous les 11q en mauvais pronostic BGMT95 11q23/MLL autres que t(9;11) mauvais pronostic

13 Les 11q23/MLL Seul screening FISH systématique recommandé (arbre décisionnel LAM) FISH double couleur cellules interphasiques=southern (sauf ITD MLL) cellules métaphasiques: identification partenaire Répertorier tous les partenaires MLL Déterminer le pronostic de chaque translocation

14 AML1 SCL

15 AML1 RUNX1/CBFA2/PEBP2aB AML2 RUNX3/CBFA3/PEBP2aC AML3 RUNX2/CBFA1/PEBP2aA Hématopoïèse ossification Développement tractus gastro-intestinal Fonction principaleGènes Les Core binding Factor : 3 sous unités et une seule 1 domaine en commun : le domaine RUNT

16 « Wing » « Tail » CBF ADN Runt A-B domaine Ig-like, semblable à p53, NF- B, STATs Le domaine Runt 128 AA très conservés Fixation à lADN et association avec CBF Reconnaissance dun motif PyGPyGGTPy R80R177R174 Forte homologie avec le gène runt de la drosophile

17 Rôle pivot dans lhématopoïèse : souris KO aml1 -/- non viables Contrôle lexpression de nombreux gènes : IL3, récepteur M-CSF, myéloperoxydase (MPO)… chaînes,, et du TCR (T Cell Receptor) inhibiteur de kinase cycline-dépendante p21WAF1 Fonctions de AML1 Fonction: Régulation de la croissance et de la différenciation des granulocytes

18 MPO IL3 GM-CSF M-CSF R TCR RUNX1 CBF LEF-1 CEBP ALY CREB P300 / CBP P-CAF RHD Ac Acetylation PU.1 c-MYB Effet activateur Effet inhibiteur NM Liaison à la matrice nucléaire co-localisation avec la RNA pol EAR2 453 RHD NLS VWRPY TAD Fixation répresseur TLE mSin3A P21 WAF et autres

19 Core Binding Factor (CBF) fréquemment réarrangé dans les leucémies t(8;21)(q22;q22) AML1-ETO (MTG8) LAM inv16(p13;q22) CBFb -MYH11 LAM t(16;21)(q24;q22) AML1-MTG16 LAM t(8;21)(q24;q22) AML1-ETO2 (TRPS1) LAM t(19;21)(q13;q22) AML1-AMP19 LAM t(3;21)(q26;q22) AML1-EVI1, AML1-MDS1, AML1-EAP LMC, SMD * t(12;21)(p12;q22) TEL-AML1 (AML1-ETV6) LAL Altération par translocations Différents partenaires *

20 Déacétylation, répression AML1 Bcl2 M-CSF R GM-CSF TCR TGF CEBP ETO RHD mSin3A N-CoR HDAC ETO MTGR1 ETO2 MTG16 Conséquences fonctionnelles Altération par translocations

21 T(8,21) et INV(16) Cytogénétique FISH ou RQPCR si echec de caryo t(8;21) et M1/M2/M4 idem+normal si inv(16)

22 Mutations constitutionnelles de aml1 Familial Platelet Disorder (FPD) prédisposition LAM altération = délétion, mutations faux-sens ou non-sens haploinsuffisance : Song et al. Nat.Genet Mutations constitutionnelles

23 Mutations acquises et hémopathies malignes (1) ~6,5% dans les HM (> 900 patients) 20-25% dans les LAM0 (34/142) Osato et al. Blood 1999 Yeoh et al. ASH 2000 Preudhomme et al. Blood 2000 Langabaer et al. GCC % dans les HM associées à Tri 21 acquises 30-40% dans les SMD secondaires (radiothérapie, chimiothérapie) Mutations acquises

24 La protéine C/EBP Facteur de transcription indispensable à la différenciation myéloïde. Fixation sur les régions promotrices du G-CSF R, GM-CSF R, MPO,... C/EBP (1)

25 Protéine C/EBP C/EBP (2) Coopération avec d autres facteurs AML1, CBF, PU-1...

26 C/EBP (4) 2 domaines de transactivation 1 domaine ZIP : Liaison au DNA Dimérisation 2 ATG d initiation Protéines de 42 ou de 30kD. Effet dominant négatif de la 30kD. Protéine C/EBP bZIP TAD1 TAD2 30 Kd 42 Kd

27 LAM et mutations de CEBPA (3) Pabst et al, Nature Genetics, vol 27, March % mutations (10/137) dans les LAM. 16% (5/30) dans les LAM2 sans t(8/21). Gombart et al, Blood, vol 99, February échantillons de tumeurs toutes confondues. 11 patients mutés: 8/78 LAM 1/92 SMD (1 AREB-T) 1/36 cancer pulmonaire à petites cellules. 1/33 cancer de la prostate

28 Descriptif des Mutations de CEBPA 1 er groupe: Mutants N-Ter Forme de 30kD: Patients 1 à 12 Wild type Patients 1, 8, 11 Patients 2, 9 Patients 4, 6, 12 Patient 5 Patient 10 Patient 7 Patient TAD1 TAD2 bZIP 42kD tronquée 30kD Dominant négatif TAD2bZIP

29 Descriptif des Mutations de CEBPA Wild type Patient 12, TAD1TAD2 bZIP Patient 7, 9, 10, 11, 14, Wild type Patient 15 Patient TAD1TAD2bZIP 2 ème groupe: Mutants C-Ter Fixation au DNA ou dimérisation altérée 3 ème groupe: partie centrale Domaine bZIP amputé

30 C/EBP : survie globale C/EBP muté = amélioration de la survie globale CEBP Muté CEBP WT P=0.03

31 A dominant-negative mutant of C/EBP, associated with acute myeloid leukemias, inhibits differentiation of myeloid and erythroid progenitors of man but not mouse Maike Schwieger, Jürgen Löhler, Meike Fischer, Uwe Herwig, Daniel G. Tenen and Carol Stocking Blood, 1 April 2004, Vol. 103, No. 7, pp C/EBPp30, a myeloid leukemia oncoprotein, limits G-CSF receptor expression but not terminal granulopoiesis via site-selective inhibition of C/EBP DNA binding Rebecca Cleaves, Qian-fei Wang and Alan D Friedman1 Blood Apr 1;103(7): Epub 2003 Dec 04. C/EBP

32 AML1-ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (1) Miyamoto et al. PNAS 2000 HSC: cellules souches; CLP: progéniteurs lymphoides MRD+ chez les patients en longue RC Altération par translocations

33 AML1-ETO Knock/In absence dhématopoièse fœtale hépatique mort des souris (Downing, Zhang, August, 2001, vol98,n°18) Souris transgèniques AML1-ETO avec promoteur myeloide-spécifique Expression dans le compartiment myéloide hématopoièse normale Si traitement ENU (mutation dans l ADN) AML1-ETO seul ne suffit pas Altération par translocations LA AML1-ETO et leucemogénèse : nécessaire et/ou suffisant ? (2)

34 Class II Mutations AML1/ETO, PML/RARa, C/EBPa lossof function C/EBPa lossof function Class I Mutations BCR/ABL, FLT3-ITD BCR/ABL, FLT3-ITD Therapy : eg, ATRATherapy : eg, imatinib mesylate, FTL3 inhibitors AML

35 Blocage de differenciation + prolifération FLT3 C-Kit RAS

36 835/836

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38 FLT3 review (Kottaridis et al, BJH 2003)(3) n % Thiede et al hyperleucocytose - M3V Schnittger et al M5 - M2 Kattaridis et al caryotype normal -11q23 <0.5% - t(6,9) - Rare CBF Pas dinfluence sur la RC, des rechutes

39 RAS 3 gènes : N, K, H RAS Mutations codons 12, 13, 61, autres LAM : N>K>H RAS 10 à 15% de mutations (25% dans les CBF) Valeur pronostique contreversée

40 Bilan : selon le caryotype

41 Groupes pronostiques (1) Selon le caryotype (MRC) favorable intermédiaire défavorable P=0.30 (NS) OS

42 Groupes pronostiques (3) Conclusion : Nouvelle classification proposée : P=0.006 Groupe 1 Groupe 3 Groupe 2 groupe 1 : MRC1, CEBP+, FLT3- groupe 2 : MRC2, RAS- et gpe 1 FLT3+, groupe 3 : MRC 3, RAS+ OS

43 C-Kit Récepteur Stem Cell Factor Mutation ponctuelle dans mastocystose (codon 816) LAM : 1,5% mutation mais inv(16) : 10-25% délétion exon 8 ; 5% D816 t(8;21) : 5% délétion exon 8 ; 5% D816 Associé à un risque de rechute augmenté

44 Survie et rechute des LAM avec mutation de c-Kit exon 8 Daprès Care et al., Br J Haematol, juin 2003

45 Allt(8;21)inv(16) N=81N=58N=33 Age (y)33 [.8-60]30.5 [4-58]34 [.8-60]NS Sex Ratio (M/F)44/3729/195/18NS WBC (G/L)21 [ ]13.4 [ ]58.6 [4-257]p=.0001 Mutations KIT15% (11/74)11% (5/42)19% (6/32)NS Ex811% (8/74)7% (3/42)16% (5/32)NS D8164% (3/74)4% (2/49)3% (1/32)NS FLT3-D8356% (5/81)4% (2/48)9% (3/33)NS RAS21% (15/71)11% (4/38)33% (11/33)p=.02 N-RAS16% (12/73)8% (3/40)27% (9/33)p=.03 K-RAS6% (4/71)3% (1/38)9% (3/33)NS

46 0,2,4,6, ,2,4,6, EFS OS Years RTK- RTK+ RTK- RTK+ P=.004 P=.0007 CBF

47 0,2,4,6, ,2,4,6, P=.0007 P=.06 OS RTK- RTK+ RTK- RTK+ t(8;21) inv(16) Years

48 RRP value RTK Mutation3.50[ ].002 CBF (t(8;21) vs inv16)3.03[ ].04 Age*1.005[ ]NS WBC*1.005[ ]NS Multivariate analysis (OS) *continuous variables

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53 BAALC (Brain And Acute leukemia cytoplasmic) - Localisé en 8q Corrélation entre +8 et hyperexpression de BAALC - Baldus et al, Blood caryotypes normaux < 60 ans CAL GB Résultats pas de différence age, sexe, flt3, NP, Hb mais BAALC faible : leuco et M5 pas influence sur RC BAALC survie : 1.7 VS 5.8 years EFS : 0.8 VS 4.9 years DFS1.4 VS 7.3 years

54 - Facteur pronostic indépendant Daprès Baldus et al, Blood 2003

55 EVI 1 - Localisé en 3q26 - Anomalies rares mais de mauvais pronostic - t(3;3) ou inv(3) hyperexpression EVI 1 et/ou EVI 1-MDS1 - Groupe Hollandais, Blood patients RQ-PCR : EVI 1 + MDS1 -6 patientsGroupe I EVI 1 + MDS1 +26 patientsGroupe II EVI 1 - MDS1 +12 patientsGroupe III EVI 1 - MDS patientsGroupe IV - EVI 1 : lié à caryotype défavorable - lien avec 11q23 - groupe I et II : pronostic très défavorable

56 Courbes de survie

57 p = 0,01p = 0,008

58 ETUDE DU PHENOTYPE MDR P.Lepelley - Laboratoire d Hématologie - CHU de LILLE 22 oct 2003

59 PHENOTYPE MDR Expression cellulaire de protéines de transport Efflux et/ou redistribution intracellulaire Résistance croisée - Glycoprotéine-P (MDR1) - MRP (multidrug resistance associated protein) - LRP (lung resistance protein) - BCRP (breast cancer resistance protein) Modulation par agents pharmacologiques

60 Etudes discordantes : problèmes méthodologiques Expression de PgP,MRP,LRP,BCRP Intérêt pronostic de la PgP

61 TEST FONCTIONNEL D EFFLUX DE LA RHODAMINE 123 Rh123 (200ng/m l) 45mn 20°C Efflux 2H 37°C + Vérapamil (10 g/ml) Spécifique de la Pgp MRP: efflux+/- > 4h non inhibé par Vp Marqueur mitochondrial (523nm) 2 temps: Accumulation (A) Efflux (E) +/- Vérapamil (V)

62 Phénotype MDR / PgP dans les LAM et SMD (247pts) Corrélation avec l age (p<0.001) et avec CD34 (p < 0.001) Age moyen: 56 ans, 96 pts 55 ans 20 cas (9 neg) étudiés au diag et en rechute/acutisation pas de conversion

63 FACTEURS PRONOSTIQUES DES LA LAM Age Leucocytose Cytogénétique FAB + DMP 2ème VS de novo + mutations : FLT3 RAS CEBPA P53 c.Kit Autres LAL Age Leucocytose Cytogénétique Phénotype préthérapeutique chimiosensibilité Délai de RC Maladie résiduelle Délai de RC Chimio sensibilité Maladie résiduelle

64 LA MALADIE RESIDUELLE Temps Rémission complète Clinique Nombre de blastes Cytologie Chimiothérapie PCR

65 INTERETS DU SUIVI DE LA MALADIE RESIDUELLE PAR RQ-PCR DANS LES LEUCEMIES AIGUES MYELOIDES PRESENTANT UNE TRANSLOCATION t(8;21)

66 MATERIEL ET METHODES I. PATIENTS 29 patients suivis au CHRU de Lille ( ) 235 prélèvements sanguins et médullaires 27 échantillons concomitants de moelle et de sang Age médian : 46 ans 21 patients homogènes 2 allogreffes 5 LAM1 5 LAM1 20 LAM2 1 LAM4 1 LAM4 3 inconnus 3 inconnus 2 interruptions thérapeutiques précoces

67 RESULTATS I. ANALYSE GLOBALE Patients Patients 100% de rémission complète en post-induction 10 patients rechutent (10 à 37 mois après le diagnostic) Survie globale moyenne : 101 mois Survie moyenne sans rechute : 70 mois Résultats de RQ-PCR Résultats de RQ-PCR 8 échantillons exploitables par patients. 28,5 mois de médiane de suivi Valeur médiane du taux de transcrit au diagnostic : (0,23 à 31,3) Valeur médiane du taux de transcrit à la rechute : 4, (2, à 24,6)

68 III. COURBES DE MR DES 21 PATIENTS HOMOGENES Catégorisation des patients Catégorisation des patientsRESULTATS 3 groupes identifiés en fonction de lévolution des courbes de suivi : Groupe A : 8 patients Groupe A : 8 patients Groupe A : 1 seule rechute Groupe A : 1 seule rechute MR < en post-induction MR < en post-induction

69 RESULTATS Groupe B : 7 patients Groupe B : 7 patients MR < dans les 6 premiers mois MR < dans les 6 premiers mois Groupe B : 0 rechute Groupe B : 0 rechute

70 RESULTATS Groupe C : 6 patients Groupe C : 6 patients Pas de MR < dans les 6 premiers mois Pas de MR < dans les 6 premiers mois Groupe C : 5 rechutes Groupe C : 5 rechutes

71 Catégories établies en fonction de la MR à 6 mois Catégories établies en fonction de la MR à 6 moisRESULTATS Temps avant rechute / Catégories p = 0, / 15 * 5 / 6 * * : nbre de rechute : patients du groupe A + B : patients du groupe C différence très significative différence très significative absence de passage de MR sous absence de passage de MR sous dans les 6 mois dans les 6 mois = facteur de mauvais pronostic Facteurs pronostiques identifiés Facteurs pronostiques identifiés

72 RESULTATS Catégories établies en fonction de la MR post-induction Catégories établies en fonction de la MR post-induction - MR > en post-induction - Chute < 3 log en post-induction différence très significative différence très significative = facteur de mauvais pronostic : patients dont la MR post-induction est < : patients dont la MR post-induction est > PFS / valeur MR post-induction (seuil = ) p = 0,006 5 / 8 * * : nbre de rechute 1 / 10 * p = 0,01 PFS / perte 3 log de MR après linduction : patients perdant + de 3log de MR après linduction ---- : patients perdant - de 3log de MR après linduction 4 / 6 * * : nbre de rechute 2 / 12 *

73 RESULTATS V. COMPARAISON MR MOELLE ET SANG 27 prélèvements concomitants de moelle et de sang Différence MR moelle - MR sang : entre -1,27 et +1,37 ; moyenne à -0,13 Différence MR moelle - MR sang : entre -1,27 et +1,37 ; moyenne à -0,13 Coefficient de détermination à 95% Coefficient de détermination à 95% = MR moelle et MR sang comparables

74 Scnittger et al, BLOOD, 2003

75

76 Krauter et al, JCO 2004

77 Others transcripts Very few data * MLL AF9 * multiple splice site : difficult * scholl et al : GCC, November patients + 2 cell lines Feasibility of RQ PCR : OK But sensitivity : LOW * less than 20 samples analyzed No clinical relevance demonstrated

78 WT1 Tumor suppressor gene located on chromosome 11p13 Involved in pathogenesis of wilms tumor High expression in ovary, testis, spleen Expression observed in more than 80% of AML Expression low in PB but variable in BM Qualitative RT PCR : few interest for MRD RQ PCR : more interesting in PB than in BM

79 Cillioni et al, Leukemia,2002

80

81 835/836

82 Kottaridis

83 Maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloïdes: approche cytométrique L. Campos P. Flandrin Laboratoire d Hématologie Hôpital Nord - CHU de St. Etienne

84 Phénotypes associés à la leucémie Expression croisée dantigènes: marqueurs lymphoïdes sur cellules myéloïdes (ou inverse). Expression asynchrone dantigènes: coexpression dantigènes de maturité et d immaturité dune même lignée. Surexpression antigénique: augmentation d expression d un antigène sur une cellule. Cellules exprimant des propriétés aberrantes en taille et structure.

85

86 Orfao et San Miguel (Blood 2001): 126 LAM en rémission complète, après la chimiothérapie d induction, >10 -2 : élevé : intermédiaire : faible < : très faible

87 Survie sans rechute à 3 ans:

88 Venditti ( 2002): 56 patients, après chimiothérapie d induction et de consolidation, résultats: après induction: taux cellules avec phénotype aberrant = 4.5 x (seuil) > 4.5 x : 53 % de rechute < 4.5 x : 40 % de rechute.

89 après consolidation: taux = 3.5 x > 3.5 x10 -4 : 77 % de rechute. < 3.5 x10 -4 : 17 % de rechute. L étude de la maladie résiduelle après consolidation semble + prédictive du risque de rechute.

90 Probabilité de survie en fonction de MDR après consolidation(Venditti, 2000)

91 Laboratoire dHématologie A Calmette U524 Inserm A.Cosson N. Grardel J.P. Kerckaert P. Lepelley H. Leroy C. Roche C. Roumier V. Soenen Techniciens Cliniciens MDS CHRU Lille F. Bauters S. De Botton B. Quesnel « P. Fenaux » J. Andrieux J.L. Laï Membres du Groupe ALFA Membres du GBMHM « Intergroupe LAM » Laboratoire de Génétique Médicale CHRU Lille


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