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Nouvelles approches thérapeutiques dans les Leucémies aiguës myéloblastiques.

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1 Nouvelles approches thérapeutiques dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

2 Cellule souche leucémique Fréquence faible 1 / Auto renouvellement:Modèle souris Bim-1,Wnt/beta caténine,Notch Différentiation CD34+/CD38- CD3+GPA+

3 LSC Phénotype CD34+;CD38-,Thy-;CD123+,CD90-,CD117- CD33+/- Quiescente dans 95% des cas en phase G0 Activation consécutive NFkb;STAT5; PI3K;Ras Interferon regulatory factor:IRF-1 Death associated Protein Kinase:DEPK Exprime mdr et Bcl2

4 LAM Modèle de leucémogénèse en deux étapes: Gilliland DG Mutations de type I Mutations activatrices de FLT3 Mutations de c-Kit Mutations de N-Ras et K-Ras Effets sur la prolifération et la survie Mutations AML1 C/EBP PU-1 ? CSL Blocage de la différenciation Mutations de type II AML1/ETO CBF /MYH11 PML/RAR Fusions MLL

5 Association entre événements Géniques CBF C-Kit dans 30 a 40% des cas Impact négatif Flt3 IDT-KT normaux /M3 -AML1 muté dans 60% pour M0 -Association MLL Dup 50 % Topo trans 64 % CEBP/ KT normaux 15% Pas association avec Flt3 Pas association avec CBF Impact positif GATA-1 M7 Sd de Down

6 Inhibition de TK et des voies de Transductions

7 Inhibition de lactivation de FLT3

8 membrane cellulaire JM C-terminal Structure de FLT3 et mutations les plus fréquentes FLT3 ITD D835Y Duplication en tandem de la région juxtamembranaire

9 FLT3 ITD Ras/MAPKSTAT5 PI3K Blocage de la différenciation par répression de CEBP/ Auto-renouvellement des cellules CD34+ via STAT5 ? Prolifération Survie cellulaire Rationnel des inhibiteurs de FLT3 Avantage de prolifération

10 FLT3 ITD D835Y 25% des LAM de ladulte t(15,17), caryotypes normaux (ITD 32%, D835Y 14%) t(8,21), inv (16), 11q23, rare dans les caryotypes complexes Hyperleucocytaire, pronostic adverse dans les caryotype normaux 33% des LAM1 avec mutation de CEBP/ Valeur pronostique ? Rapport ITD/allèle normal, délétion allèle normal, mutations des 2 allèles

11 Inhibiteurs de Flt3 SU11248 Fiedler Onc wt,Itd5 (2Flt3*) SU11248 Fiedler Blood wt,ITD4/4 Itd 2/7WT 2 a 7 semainesDisparition de Flt3* CEP701 Allebach Blood Itd5 Amélioration2 a 15 semaines Corrélation activité déphosphorylation PKC412 Stone Blood Itd2RC;4RP9et 47semaines Corrélation activité déphosphorylation MLN518 De Angelo Blood ItdSang 6(92%) Moelle 6(62%) 1 et 15 semaines Traitement Patients Réponse Durée

12 Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM Questions Évènement secondaire. Tardif ? Probablement Expression de lITD dans un sous clone ? Sûrement Mutations présentes dans le compartiment de CSL ? Probablement pas Indication chez les patients FLT3 non mutés ?

13 Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM Mécanismes de résistance ? Mécanismes de résistance intrinsèque Pas de mutation secondaire de FLT3 actuellement décrite La sensibilité aux inhibiteurs diffère selon le type de mutation D835 ou de ITD (Clarck JJ, Blood, 2004, July 15) Mutation G697R proche de la boucle dactivation: résistance totale à PKC412, CEP-701, SU5614 (Cools J, Cancer Research, 2004, 64, 6385)

14 Inhibiteurs de FLT3 dans les LAM lavenir ? Patients en première ligne de traitement Association à la chimiothérapie Association à linhibition de voies de signalisation situées en aval ? - Effet synergique in vitro avec Aracytine et Daunorubicine (Yee KWH, Blood, 2004, August 10) Diminution des doses de chimiothérapie chez les sujets agés ? - Importance de la séquence dadministration (Levis M, Blood, 2004, May)

15 Inhibition du récepteur c-KIT

16 c-Kit c-Kit dans les LAM Prolifération Survie migration 60-80% des LAM expriment c-KIT le SCF fait proliférer les blastes in vitro Rôle paracrine+ Rôle autocrine ? surexprimé (10%)

17 c-Kit Mutations de c-Kit dans les LAM D816 D419 délétion/insertion mutations de lExon 8 incidence globale < 5% Association particulière avec les LAM CBF+ Care RS, BJH, 2003, 121, LAM de novo 63 inv16 47 t(8,21) D % 2% D % 10.6% total 31% 12.6% FLT3* 7.9% 5.6% hyperleucocytaire, pronostic adverse ? 43.6% mutation activatrice probable

18 c-Kit Mutations de c-Kit D816 D419 délétion/insertion mutations de Exon 8 Résistance au glivec Sensible au PKC412 Glivec ? PKC412 ? autres: MLN518, PD ? BMS Sensible MLN518

19 Inhibition de c-Kit Mesters RM, Blood, 2001, 98, 241 Femme 62ans LAM4 réfractaire. c-KIT+, VEGFR2 (KDR)+, FLT3 ? del9q SU5416: 145mg/m2/jour IV RC obtenue en 12 semaines dune durée de 4 mois Diminution de langiogénèse médullaire Kindler T, Blood, 2003, 101, 2960 Homme 64 ans LAM2 secondaire à ASIA, trisomie 8, c-KIT+ non muté, PDGFR+/- Glivec: 600mg/jour RC obtenue en 5 semaines dune durée de 5 mois Amélioration cytogénétique

20 Essai de phase II par le Glivec dans les LAM (Kindler T, Blood, 2004, 103, 3644) 21 patients c-KIT+ non mutés, avec phosphorylation du récepteur Glivec 600mg/jour Bonne tolérance 5 réponses, dont deux RC mais administration à J31 et J24 dune chimiothérapie et 2RP

21 Inhibition du récepteur au VEGF

22 Padro T, Blood, 2000, 95, 2637 Néoangiogénèse dans les LAM Augmentation de synthèse du VEGF

23 Autocrininie - Extracellulaire - Boucle autocrine intracellulaire Système VEGF/VEGFR dans les LAM VEGF VEGFR1 (flt1) et VEGFR2 (KDR/flk1)

24 Inhibition du VEGF dans les LAM SU5416 (KDR, c-KIT, FLT3) Stopeck GFJ, Blood, 2003, 102, 795 Fiedler W, Blood, 2003, 102, 2763 SU11248 (KDR, PDGF, FLT3) Fiedler W, Blood, Rôle a préciser Fiedler RC sur 25patients

25 Voie NF- B dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

26 Voie NF- B et cellules souches leucémiques Guzman ML, PNAS, 2002, 99, Activation NF- B constitutive dans les CSL Linhibition de la translocation de NF- B induit une apoptose p53 dépendante. Inhibiteur du protéasome. Inhibiteur du protéasome + Idarubicine. IkB super-répresseur Comment est activée la voie NF- B ? Comment inhiber spécifiquement NF- B ? IKK IkB NF-kB Noyau Protéasome Gènes anti-apoptotiques, prolifératif kB site binding NF-kB IkB S32 S34

27 Inhibiteur de NFkb Romano et Al Leukemia 2003;1190

28 Inhibiteur de NFkb Frelin c et al Blood 2005,804 Utilisation de AS inhibiteur de IKK Potentialisation vis a vis Ara c VP16 Doxorubicine Abolition de Phosphorylation NF b Activation de la caspase-3 Étude de phase 2

29 Voie de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K/AKT) dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

30 Voie de la phosphoinositide 3-kinase/AKT AKT PDK1 PDK2 Thr308 Ser473 P P mTOR P croissance FOXO3a BAD Fas-LBim P P Survie MDM2 p53 P Survie GSK3 Cyclin D1 P Prolifération IKK NF- B P P Survie PI(4,5)P 2 PI(3,4)P 2 PI(3,4,5)P 3 SHIP-1 PTEN GAB RTK P TK P P P p110,, p85 PI3K

31 Il existe une activation constitutive de la voie PI3K/Akt dans 50% des LAM Déprivation 2H 4H 8H P35, LAM4, blastes 90% p-Akt (Ser 473) p-FOXO3a (Thr 32) Actine Indépendante du FAB Indépendante des mutations de FLT3 Avantage de croissance in vitro

32 LY (25µM) : p-FOXO3a (Thr 32) P51, LAM2, blastes 88% Actine p-Akt (Ser 473) IC87114 (10µM) : Patient LY MilieuIC LIC87114 (inhibiteur de la p110delta) inhibe la prolifération des blastes PI3K+ LIC87114 na pas de toxicité sur les cellules CD34+ normales Interet pour une phase 1-2

33 La voie mTOR/P70S6K/4E-BP1

34 mTOR Rapamycine Rad-001 CCI-779 FKBP-12 Arrêt du cycle cellulaire Apoptose Inhibition de langiogénèse Rapamycine Activation constitutive de la PI3K Hypersensibilité à la rapamycine

35 Inhibition de la voie mTOR en clinique ?

36 12 patients (Octobre 2003-mars 2004) –Age médian: 72 ans (55-77) –Réfractaire (n=4) / Rechute (n=5) / Secondaire (n=3) –Rapamycine (sirolimus, Rapamune®, Wyeth) –6 mg à J1 puis 2 mg/J pendant 28 jours –Réponse hématologique: Réduction de plus de 50% des blastes sanguins et/ou médullaires Etude pilote. C Récher

37 –Pharmacocinétique variable+++ –4 réponses, 7 progressions et 1 stable à J28 –Durée de traitement: 50 (21-240) –Durée de réponse= 38 jours (35-120) –2 répondeurs vivants à 9 et 11 mois Etude pilote. C Récher

38 4 répondeurs à J28

39 Voie des protéines JAK/STAT dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

40 P P P P P P Stat P P JAK X c-myc c fos FT Noyau Cytoplasme La voie dactivation des facteurs de transcription STAT

41 La voie JAK/STAT dans les LAM Activation constitutive de STAT3 et/ou STAT5 dans 30-70% des LAM Activation associée aux mutations de FLT3 ? Rôle dans la prolifération, la survie des cellules blastiques ? Auto-renouvellement ? Lactivation constitutive de STAT3 confère un pronostic Adverse (DFS) Benekli M, Blood, 2002, 99, 252

42 Inhibition de la voie JAK/STAT STATs JAK AG490 CIS/SOCS PIAS NH2 COOH SH2 DBD TA Y LD Inhibition de la dimérisation STAT3: PY*LKTK Activation de phosphatases SHP1/SHP2PP2A Anti-sens Inhibition de la transcription STAT3 DN Séquences consensus ADN

43 Voie des protéines Ras-ERK/MAPK dans les Leucémies aiguës myéloblastiques

44 Signaux extracellulaires RAS RAF MEK MAPK MAPKK MEKK MAPK Elk-1 Rsk Bad BclX Histone H3 SRE C- myc Ap1 cdc25 Cyclines D PD UO126 Bad BclX Progression dans le cycle Survie FTI

45 La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM Activée dans 50-90% des LAM, indépendamment des mutations activatrices de Ras Contrôle la prolifération et la survie des cellules blastiques Thérapeutique:Synergie sur linduction dapoptose avec linhibition de lexpression de Bcl-2 (AS)

46 La voie Ras; ERK/MAPK dans les LAM Phase 1 FTI dans les LAM Karp Blood patients 2RC durée de 3 a 7 mois et 6 RP Dose entre 600mg et 1200mg Phase 2 FTI dans les LAM réfractaires et en rechutes Harousseau ASCO % de RC Phase 2 LAM non traitée et les SMD Blood % de réponse dont 12 RC Indépendamment de linhibition de la Farmestylation et mutation Ras

47 Induction de lApoptose en bloquant les voies anti apoptotiques : modèle des anti Bcl-2 Genasense:G3139 Peptides anti Bcl-2

48 Genasense et LAM Phase 1 Genasense and FLAG in relapse or refractory leukemia Marcucci et al Blood 2003; LAM réfractaire ou en rechute (médiane 7 mois) Genasense de J1 a J10 et FLAG de J5 a J10 5RC et 2 RCu entre 83 et 565 jours La durée de 2Rc est supérieur a la première Phase 2 Moor et al Blood Patients LAM en rechute,age >60 ans Association Genasense et Mylotarg (9mg) 30% de RC ou RCu

49

50 Peptides interagissant entre Bcl2 et BAX Shangary et Al Mol Cancer Ther 2004;3 Peptides interagissant avec BH3BAX libère BAX et induit apoptose Peptides de 15 AA qui interviennent dans BAX-Bcl-xL et BAX Bcl2

51 Les Anticorps Anti CD33 avec calicheamicin Anticorps I 131 ou Y 80 Anticorps DT

52 Mylotarg et LAM Mylotarg Sievers J clin Onc LAMRechute9mg/m 2 x230% RC Mylotarg Nabhan Leuk rec LAMNT6mg/m 2 x227% RC Mylotarg+/- IL11 Estey Blood LAM SMD NT9mg/m 2 x28%sans IL11 36%avec IL11 Influence du KT Mylotarg Fluda Arac ciclo Estey Cancer LAMNT6mg/m 2 48% RC Mylotarg +IA Estey Leu chemo Pharma LAMRechute Réfractaire 6mg/m 2 x247% RC

53 Anticorps et DT DT-GM Frankel et al Clin Cancer Res RC sur 34 LAM rechute réfractaire Problème Anticorps neutralisant (30%), Hall PD Clin Immunol 2001 Toxicité hépatique DT-IL3 Toxicité sur les LSC et non les HSC,Frankel Leukemia 2000 Inhibe la colonisation des NOD/SCID par les LSC et non les HSC Black Leukemia 2003 DT-Urokinase (CD87) Présent sur les cellules souches

54 DIFFERENTIATION Anti CD44 Inhibiteur des Histones deacethylases

55 Anti-corps activant CD44 Récepteur de Ac Hyaluronique Présent sur les cellules souches normales et leucémiques Blocage inhibe la myélopoiése Induit la différentiation de lignées myéloïdes: NB4,THP-1,HL60 Bloque apoptose induit par la chimiothérapie(Doxo,VP16,Mitoxantrone) Inhibe la greffe secondaire des CSL dans des NOB/SCID

56 Différentiation et CD44 F Smadja-joffre Nature Med 1999 NTCD14/CD15Cytologie LAM370%79% DIFFERENTIATION LAM541%58% DIFFERENTIATION LAM430%32% 0 LAM1/220%42% 0

57 Mode action des CBF

58 Dominant négatif sur la synthèse de gènes GM-CSF;P21;CBF Activateur de génes cibles Bcl2 ;Mdr Bloque la différentiation :Rôle des HDAC

59 Inhibiteurs des HDAC Butyrate Acide Hydroxamique(acide suberoylanilide ou SAHA) Tetrapeptides cycliques(Depsipeptide) Benzamides (MS-275) Acide cinnamique Hydroxamate(NVP-LAQ824) Acide Valproique

60 Mode action des HDACI Les HDACI Apoptose par: expression de TRAIL et de son Récepteur Blocage de la prolifération par: expression de la P21 Induise une différentiation par: expression de la P21 Interet dans les LAM Nebbioso A Nature Med patients 90% présente une apoptose Weisberg E Leukemia 2004

61 HDACI MS275 Nebisso Nat Med 2005 Différentiation Apoptose

62 Conclusion 1 Lavenir est il à lassociation concomitante de plusieurs inhibiteurs ciblant des RTK et des protéines de signalisation? Probablement oui Diminuer le risque démergence de mécanismes de résistance aux inhibiteurs de RTK Potentialiser les effets apoptotiques Augmenter le degré dinhibition dune voie de signalisation en linhibant à plusieurs niveaux dactivation Restaurer une sensibilité aux inhibiteurs de mutants résistants de RTK

63 FLT3 PI3K Akt TSC2 TSC1 Rheb GTP Rheb GDP mTOR P70S6K 4E-BP1 ITD Ras Raf MEK MAPK PKC412 Mohi MG, PNAS, 2004, 101, 3130 sensibilité restaurée dun mutant résistant à PKC412 rapamycine < PKC412 + rapamycine UO126 < PKC412 + rapamycine + U0126

64 CONCLUSION 2 -Association a la chimiothérapie traditionnelle? Oui pour agir sur ensemble des cellules leucémiques -Faut il mieux caractériser les LAM ? Sûrement il faudra a avenir: Connaître les anomalies des TK Des voies activationsPI3K,STAT ;Ras,ERK -Quels sont les drogues a tester ? Les inhibiteurs de TK :BMS Les Inhibiteurs de NF b Les HDACI


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