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Electrophysiologie Moléculaire LSV3. I-Historique Emergence des concepts.

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1 Electrophysiologie Moléculaire LSV3

2 I-Historique Emergence des concepts

3 1.1. Biolélectricité I-Historique Poisson torpille (45 V) silure Gymnote (350V)

4 I-Historique -XVIII è s: Fluide de même nature que la foudre -Contraction du muscle gastrocnémien de grenouille: obtenue en reliant 2 Points du nerf rachidien par un fil métallique Notion de « fluide nerveux » et « dElectricité Animale » (L. Galvani)

5 1.2. Premieres expériences I-Historique - Patte Galvanoscope

6 -Electromètre Courant de repos dun muscle sectionné Potentiel de lésion de repos dun nerf sectionné (Dubois_Reymond, 1850) -Loi dOhm -Electrochimie -Définition de la charge unitaire: lélectron Sadapte aux électrolytes I-Historique

7 1.3. Premières théories: fin XIXè siècle I-Historique -Vitesse de linflux nerveux (30 m.s -1 ) -Potentiomètre et Rhéotome: Mesure de la durée du PA: 0,7 s; se propage à la vitesse de lIN -Focalisation sur la fibre nerveuse Segment excité – par rapport au reste de la fibre Excitation de proche en proche -Excitabilité électrique du nerf (seuil) -Loi du tout ou rien -Période Réfractaire,….

8 I-Historique -Focalisation sur les propriétés de perméabilité de la membrane, perméabilités ioniques (membrane semi perméable): Début XX: le passage des ions peut sous-tendre un courant perméabilité sélective à certain ions: DDP -Equation de Nernst (1889): -FEM et potentiel de repos

9 -Théorie de Bernstein (1902) -Le potentiel de repos est du au passage sélectif du K+ par des « canaux de fuite »: 2 K+ / Vr= E K MAIS: ça ne marche pas pour toutes les cellules: OK pour cellules gliales, pas pour les neurones - La dépolarisation lors du PA: perte de sélectivité transitoire de la membrane (faire un dessin).

10 1.4.Approche expérimentale du PR et du PA I-Historique -Progrès techniques de la 1 ère moitié du XXè siècle - Electrode intracellulaire - Expériences de Hodkin et Huxley - Cellule envisagée comme un circuit RC

11 1947: Hodkin et Huxley Stimulation Courant ctrl -K+/-Na+ -Na+ -K+ Contradiction avec le modèle de Bernstein I-Historique Courants ioniques enregistrés à partir dun axone géant de Calamar -V r proche de E K -Dépolarisation: Na -Activation retardée de I K

12 2- Rappels Nernst, gradient E-chimique, FEM, courant ionique

13 II-Rappels FEM = V m - V eq Si FEM < 0 Entrée de cations (sortie danions) provoquant une dépolarisation Si FEM > 0 Sortie de cations (entrée danions) provoquant une hyperpolarisation Conventions: Potentiel de membrane E m = V m = E in - E out I (A) 0 Courant positif (sortie de cation /entrée danion) Courant négatif (sortie danion/entrée de cation)

14

15 3- Modèle dHodkin- Huxley Théorie ionique, équations phénoménologiques

16 Modèle de laxone géant de Calamar

17 Stimulation Courant ctrl -K+/-Na+ -Na+ -K+ I-Historique

18 3.1. Phase expérimentale III-Hodkin Huxley FEM= V m - E eq FEM = R I FEM = I/G I = G * FEM = G * (V m- E eq ) R= résistance membranaire G= 1/R = Conductance membranaire

19 Phénomènes observés lors Du PA: -Conductances sélectives (G Na et G K ) -Activation /dé-activation (seuil) -Inactivation (réactivation) II-Hodkin Huxley

20 3.2.Equations phénoménologiques de HH II-Hodkin Huxley I total = I c + I Na + I K + I f I Na = G Na * (V m – E Na ) I K = G K * (V m – E K ) I c = C * dV/dt G Na = m 3 h * G Na max G K = n 4 * G K max n et m: variables dactivation (vdep) h: variable dinactivation (vdep)

21 II-Hodkin Huxley Sensibilité au potentiel de n, m et h: Transition de particules chargées (n, m et h) entre 2 positions: n= 1- e (-t/ ); n= f(t) occupé: conduction n 1 - n n n libre: non conduction n = f(V), n = f(V) Exemple de n pour G K: Fraction de sites occupés: n; n : vitesse transition inoccupé/occupé; n : vitesse de transition occupé/inoccupé dn/dt = n (1-n) – n. n Si V constant, dn/dt = 0 donc: n (1-n) = n. n doù: n = n / [( n + n )] Toute variation de potentiel produit une variation de n qui tend vers n ss = n / ( n + n ); 0 < n ss < 1 n 4 et m 3 h: proba pour les portes d être à létat ouvert ou fermé en fct du potentiel Prix Nobel en 1953

22 Prédiction des caractéristique des Canaux Vdep 30 ans avant leur découverte II-Hodkin Huxley

23 Equation de Boltzman: évolution de h ss, n ss et m ss en fonction du potentiel de membrane (conductances Vdep)

24 4-Potentiel de Repos Bases théoriques

25 4.1.Equation de courant GHK Assumptions underlying the validity of the equation Several assumptions are made in deriving the GHK current equation: The membrane is a homogeneous substance The electrical field is constant so that the transmembrane potential varies linearly across the membrane The ions access the membrane instantaneously from the intra- and extracellular solutions The permeant ions do not interact The movement of ions is affected by both concentration and voltage differences IV-Potentiel de repos - GHK

26 Léquation: The GHK current equation for an ion S: where I S is the current across the membrane carried by ion S, measured in amperes (A = C·s -1 )amperes P S is the permeability of ion S measured in m 3 ·s -1 z S is the charge of ion S in elementary chargeselementary charges V m is the transmembrane potential in voltsvolts F is the Faraday constant, equal to 96,485 C·mol -1 or J·V -1 ·mol -1Faraday constant R is the gas constant, equal to J·K -1 ·mol -1gas constant T is the absolute temperature, measured in kelvins (= degrees Celsius )absolute temperature [S] i is the intracellular concentration of ion S, measured in mol·m -3 or mmol·l -1 [S] o is the extracellular concentration of ion S, measured in mol·m -3 IV-Potentiel de repos - GHK

27 Courves I/V résultant de leq (I) de GHK: rectification NB: le modèle nest pas linéaire comme limplique la loi dOhm IV-Potentiel de repos - GHK Dessin au tableau

28 4.2. Equation de potentiel de GHK The Goldman-Hodgkin-Katz Equation V m is the membrane potential. This equation is used to determine the resting membrane potential in real cells, in which K +, Na +, and Cl - are the major contributors to the membrane potential. Note that the unit of V m is the Volt. However, the membrane potential is typically reported in millivolts (mV). If the channels for a given ion (Na +, K +, or Cl - ) are closed, then the corresponding relative permeability values can be set to zero. For example, if all Na + channels are closed, p Na = 0. R is the universal gas constant (8.314 J.K -1.mol -1 ). T is the temperature in Kelvin (°K = °C ). F is the Faraday's constant (96485 C.mol -1 ). p K is the membrane permeability for K +. Normally, permeability values are reported as relative permeabilities with p K having the reference value of one (because in most cells at rest p K is larger than p Na and p Cl ). For a typical neuron at rest, p K : p Na : p Cl = 1 : 0.05 : Note that because relative permeability values are reported, permeability values are unitless. p Na is the relative membrane permeability for Na +. p Cl is the relative membrane permeability for Cl -. Constants Universal Gas Constant (R) = J.K -1.mol -1 Faraday's Constant (F) = C.mol -1 IV-Potentiel de repos - GHK

29 ml

30 5.Canaux ioniques

31 5.1.Découverte The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1991 "for their discoveries concerning the function of single ion channels in cells" Erwin NeherBert Sakmann Invention du patch-clamp V- Canaux ioniques

32 Canaux ioniques- mise en évidence -HH: Binding TEA / TTX sur des sites protéiques -1969: Inclusions de pores et fluctuation de g; crénaux :Modélisation math t o, = 1/t o ; t f, = 1/t f Arguments indirectes en faveur de lexistence de « pores » sélectifs au sein de la membrane. Des indices de lexistence de « portes discrètes »

33 Premiers enregistrements de canaux unitaires (1976 ) Plaque motrice de grenouille, effet de lAc Choline Invention du patch clamp Nature, Canaux ioniques- mise en évidence Notion de Po

34 Probabilité douverture: Po P o = = OC i = (V m – E ion ) = i (V m – E ion ) T ouvert T total Canaux ioniques - analyse

35 Du courant unitaire au courant global: reconstruction I = n * P o * i = nP o FEM = nP o (V m – E ion ) nP o G n G max ; (Po = 1) Imax = Gmax * FEM

36 Canaux ioniques- la technique de patch clamp Les configurations: Les modes: Potentiel imposé: V m – E ion = R * I Courant imposé: V m – E ion = R * I Cell attached, patch excisé: courants unitaire (i), conductance unitaire ( ) Whole cell: I = n *Po* i; G = n*Po*

37 Canaux ioniques- Généralités On classe les canaux en fonction de: -la sélectivité -le gating - la nature moléculaire - la pharmacologie

38 Canaux Ioniques Généralités

39 La sélectivité OUTSIDE THE ION FILTER (upper fig.) Outside the cell membrane the ions are bound to water molecules with certain distances to the oxygen atoms of the water. INSIDE THE ION FILTER (lower fig.) For the potassium ions the distance to the oxygen atoms in the ion filter is the same as in water. The sodium ions, which are smaller, do not fit in between the oxygen atoms in the filter. This prevents them from entering the channel. Canaux ioniques- Généralités

40 Le « gating » La Po peut être modulée par différents paramètres selon les canaux: -Potentiel de membrane Canaux K V, Na V, Ca V et Cl - (ClC) -Messager extracellulaire Canaux GABA A, NMDA, Kainate, ….. -Protéine G K Ach ( ) - Second messager Ca 2+, AMPc: canal f -Sress mécanique TREK (2P) - pH (ASIC,….) - Température Canaux ioniques- Généralités

41 Nature moléculaire, familles génétiques: exemple des canaux K+ Canaux ioniques- Généralités

42

43 Les canaux voltage -dependants

44 Structure: - 4 SU pore -6 DTM -SU : régulatrice Canaux ioniques voltage dépendants

45 Left: Architecture of the KvAP channel. KvAP channel tetramer viewed from the intracellular side of the membrane. Each subunit is a different colour; helical elements of the blue subunit are labelled numerically for S1–S6 and with P for the pore helix. N and C mark the termini; right KvAP channel tetramer viewed from the side with the intracellular solution below. Side chains of selected residues known to be involved in voltage-dependent gating are shown on the blue and red subunits. Selected helical elements are labelled on the red and blue subunits. (Taken from Jiang et al., 2003) Jiang et al., 2003 Canaux ioniques voltage dépendants Gating: un récepteur au potentiel….

46 Canaux ioniques Voltage dépendants

47 Etude des courants macrospcopiques (A) Canaux ioniques voltage dépendants Courbe I/V: I= n* Po * i I= n * Po * FEM * NB: n et sont des cst Courant K+ Courant Na+ On observe: -seuil dactivation -Evolution de I en fonction de Po et FEM

48 Courant macroscopique et potentiel dinversion (B) Canaux ioniques voltage dépendants Le protocole fixe Po pour extraire I = f (FEM) La courbe est ajustée par léquation de potentiel de GHK, si le canal le permet (rectification normale)

49 Courants macroscopiques et activation (C) Canaux ioniques voltage dépendants Comment déterminer Po? -Courants de queue -Par le calcul La courbe est ajustée par une fonction de Boltzmann (en accord avec les prévisions de HH!) Le protocole fixe FEM pour extraire I = f (Po)

50 Courants macroscopiques et inactivation (D) Canaux ioniques voltage dépendants Comment déterminer linactivation? -Courants de queue Le protocole fixe FEM et P o pour extraire I = f (Inactivation) La courbe est ajustée par une fonction de Boltzmann (en accord avec les prévisions de HH!)

51 Mécanisme dinactivation -N-inactivation à partir des SU ou - C-inactivation par pincement du filtre de sélectivité

52 Conclusions Signature électrique dune cellule

53 Canaux et douleur

54 Canaux ioniques impliqués dans les processus nociceptifs 3.1. Récepteurs canaux des AA excitateurs 3.2. Récepteurs canaux du GABA 3.3. Récepteurs canaux VR Récepteurs canaux sensibles au proton 3.5. Canaux Na+ Vdep 3.6. Canaux Ca2+ Vdep 3.7. Canaux K Expression des canaux et douleur chronique

55 3.1. Récepteurs canaux des AA excitateurs

56 - AMPA (a amino 3hydroxy 5 methyl 4 isoxazolepropionate) - Kainate - NMDA Canaux Na +, cinétique rapide Neurotransmission excitatrice rapide Canal de type Ca 2+ préférentiellement Cinétique lente, complexe (plasticité) Mg 2+ Glycine

57 Modulation des R NMDA par le Mg2+

58 Modulation des R NMDA par la Glycine

59 NMDA et douleur chronique Activité FAP AAE Modifications génomiques à long terme Hyperexcitabilité Lésion Ca 2+ (NMDA)

60 NMDA et douleur chronique

61 3.2 Récepteurs GABA GABA A GABA C GABA B Récepteurs canaux I Cl- Récepteur métabotropique Adénylate cyclase I K+

62 3.2 Récepteurs GABA GABA; Neurones GABAergiques. Constriction ou section du nerf sciatique. Section du nerf sciatique GABA B R-GABA A dans la corne dorsale. Inflammation GABA et neurones gabaergiques

63 3.3 Récepteurs canaux à la capsaïcine - la capsaïcine est un vallinoïde qui stimule les fibres C des muqueuses et de la peau -Brûlure -Hyperalgésie persistante -Ces récepteurs appartiennent à la famille des TRP - TRPC (« Classical »): SOC - TRPV : VR1, VR2 exprimé dans les DRG. - TRPM: Mécanorécepteur? - TRPN - TRPP - TRPML

64 3.3 Récepteurs canaux à la capsaïcine VR1: 838 aa et 6 DTM; canal cationique très perméable au Ca 2+ ; exprimé dans DRG - Chaleur - Potentialisé en présence de H + Dépolarisation

65 3.3 Récepteurs canaux à la capsaïcine

66 3.4 Récepteurs canaux sensibles au H + pH Inflammation Ischémie Intensité de la douleur Expérimentalement: Une baisse locale de pH induit une dépol rapide, suivie dune inactivation ou dune phase soutenue selon le type de neurone sensoriel….

67 3.4 Récepteurs canaux sensibles au H + - Découverte de canaux acitivés par le proton: ASIC « A proton-gated cation channel involved in acid-sensing. Nature, 1997 » Waldmann R, Champigny G, Bassilana F, Heurteaux C, Lazdunski M. Institut de Pharmacologie Moleculaire et Cellulaire, CNRS, Valbonne, France. - Structure à 2 DTM; appartiennent à la famille des Canaux Na+ amiloride sensible. - 4 membres: ASIC1, ASIC2, ASIC2b, ASIC3 ASIC1 ASIC2 ASIC2b Cerveau ASIC1 ASIC2b ASIC3 Neurones sensoriels

68 Copyright ©1998 by the National Academy of Sciences Characteristics of the pH response in COS-7 cells expressing ASIC-[beta]

69 Bassilana, F. et al. J. Biol. Chem. 1997;272:

70 3.5 Canaux Na + Vdep -Une SU -Deux SU aux

71 3.5 Canaux Na + Vdep Dans DRG, 2 types principaux: TTXs et TTXr TTXs: PN1 et PN4 Cinétique rapide TTXr: SNS (PN3) et NaN; Cinétique plus lente. SU spécifiques des DRG Colocalisation de PN3 et R-capsaïcine dans fibre C et neurones DRG de petit diametre Linflammation (PGE2, adénosine, sérotonine) diminue le seuil dactivation Des TTXr par phosphorylation de la SU alpha; De même, augmentation de la densité de courant par augmentation de lexpression de alphaPN3.

72 3.5 Canaux Na + Vdep Douleur chronique: Modifications génétiques diminuant le seuil dactivation Décharges ectopiques De la densité de canaux dans la zone de lésion; du ratio TTXr/TTXs

73 3.6 Canaux Ca 2+ Vdep Plusieurs type: N, L, P, Q, R; T Rôle de chaque type? Impliqués dans linflux calcique et la sécrétion synaptique (Glu, peptides) N: - présents en grande quantité dans les FAP (neuromédiateurs) - ME: fortes densité dans les couches I et II où se projettent les fibres delta et C. Rôle??? Pharmaco: le bloquage spécifique des N réduit certains types de douleur

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75 a) Nociceptive pain is produced under physiological conditions only by noxious stimuli acting on high-threshold nociceptors. (b) With inflammation, components of the 'inflammatory soup', such as bradykinin or prostaglandins, bind to G-protein-coupled receptors and induce activation of protein kinases A and C in nociceptor peripheral terminals, which then phosphorylate ion channels and receptors. As a result, the threshold of activation of transducer receptors such as TRPV1 is reduced, and the excitability of the peripheral terminal membrane increases, producing a state of heightened sensitivity, termed 'peripheral sensitization'. (c) After injury to nociceptor neurons, increases in transcription or altered trafficking of sodium channels as well as a reduction in potassium channels increases membrane excitability sufficiently so that action potentials are generated spontaneously (ectopic activity). (d) Activity-dependent signal transduction cascades and signaling pathways downstream to receptors bound by cytokines and growth factors act to modify transcription in nociceptor neurons. Altered production of numerous proteins modifies the phenotype of the neurons, changing their transduction, conduction and transmission properties.


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