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Helicobacter pylori, inflammation chronique et cancer gastrique Hilde de Reuse Unité de Pathogenèse de Helicobacter Institut Pasteur,

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1 Helicobacter pylori, inflammation chronique et cancer gastrique Hilde de Reuse Unité de Pathogenèse de Helicobacter Institut Pasteur, PARIS

2 Jusquen 1983, on pensait que lestomac était un organe stérile et que les ulcères de lestomac étaient causés par le stress pH median de lestomac = 2

3 1886 : identification de bactéries spiralées dans des lavages gastriques humains par Walery Jaworski (Université de Cracovie) 1893 : description de bactéries spiralées dans lestomac dun chien par Giulio Bizzozero (Université de Padoue) Anciennes observations de bactéries dans lestomac...

4 Ces observations ne montrent pas que la bactérie cause une maladie

5 1) Analyse de biopsies de lestomac de 135 patients souffrant de gastrite et de biopsies de patients sains => identification dune bactérie spiralée uniquement chez les patients souffrant de gastrite 3) Barry Marshall démontre lun des postulats de Koch en avalant une culture de cette bactérie quils appellent Helicobacter pylori En le travail exemplaire de deux médecins australiens, R. Warren et B. Marshall 2) Culture de cette bactérie pure in vitro

6 R. Warren et B. Marshall 2005: R. Warren et B. Marshall Prix Nobel de Médecine pour la démonstration du rôle de la bactérie Helicobacter pylori dans le développement des maladies de lestomac

7 La bactérie Helicobacter pylori Gram négatif Classe des epsilon protéobactéries Spiralée et fortement mobile H. pylori colonise exclusivement lestomac des humains et des primates non-humains H. pylori colonise exclusivement lestomac des humains et des primates non-humains Helicobacter pylori : chef de file dun nouveau genre bactérien

8 Helicobacter pylori chef de file dun nouveau genre bactérien

9 Infections par Helicobacter pylori

10 - - très forte prévalence, la moitié de la population humaine mondiale - fortes disparités géographiques (niveau socio-économique)

11 Mode de transmission : - inter-humaine - acquisition par voie oro-orale - acquisition au cours de la petite enfance - transmission le plus souvent intrafamiliale - infection persiste souvent toute la vie Epidémiologie de linfection par Helicobacter pylori

12 Prévalence des infections à H. pylori Dans les pays occidentaux => lincidence diminue - 66 % de la population de lâge de 60 ans est infectée - 22 % de la population de lâge de 20 ans est infectée Effet cohorte

13 Asymptomatique (80%) Ulcères gastriques ou duodénaux (10%) Gastrite atrophique Adénocarcinome (1-3%) Lymphome du MALT (0.3%) Gastrite chronique (100%) Infection par H. pylori Métaplasie intestinale Dysplasie Pathologies associées à linfection par H. pylori Dyspepsie fonctionnelle (5-10%) <1a 20-30a 65-80a 30-50a

14 Caractéristiques génétiques de lhôte Génotype de la bactérie Facteurs de lenvironnement et mode de vie de lhôte Risque accru d'atrophie gastrique et d'adénocarcinome Polymorphismes des cytokines pro-inflammatoires -> TNF et IL1 β (puissant inhibiteur de la sécrétion acide gastrique) (îlot de pathogénicité Cag, VacA-s1m1)

15 Trithérapie de 7 jours : combinaison de deux antibiotiques parmi (Amoxicilline, clarithromycine, tétracycline, métronidazole) + inhibiteur de Pompe à Protons (IPP) Nouveaux traitements (90% éradication) - séquentiel - IPP, Tetracycline, Metronidazole, Bismuth Traitements des infections à Helicobacter pylori Apparition préoccupante de souches résistantes Souches isolées de 530 biopsies ( , France) 26% clarithromycine R 61% métronidazole R 0% amoxicilline R (Raymond et al. Helicobacter 2010)

16 Helicobacter pylori et cancer gastrique 1994 : reconnaissance internationale de H. pylori comme oncogène de classe I par lagence internationale de recherche sur le cancer (IARC)

17 Principaux agents impliqués : Bactérie : Helicobacter pylori 5.5% Virus :Papilloma Virus humains 5.2% Virus des Hépatites B & C 4.9% Virus dEpstein-Barr 1% VIH & HHV8 0.9% HTL Virus 0.03% Parasites du foie : 0.02% (Parkin, Int J Cancer 2006) Cancers associés aux infections cancers gastriques Nombre total de cancers attribuables aux infections en 2002 : million de cas dans le monde - 18% de lensemble des cancers

18 Le cancer gastrique en chiffre nouveaux cas/an dans le monde 2 ème cause de mortalité par cancer dans le monde (2/3 des cas dans pays en voie de développement) morts par an dans le monde En France : nouveaux cas/an Survie à 5 ans : % Cancers gastriques associés à H. pylori 90 % des lymphomes gastriques de type MALT 71 % des adénocarcinomes gastrique distaux (de type intestinal ou diffus)

19 Uemura et al. N. Engl. J. Med. (2001) Sur les 280 patients non-infectés par H. pylori ou infectés et traités aucun na développé de cancer - Suivi longitudinal sur 10 ans de 1526 patients japonais * 4,7 % Dyspeptiques 3,5 % Ulcères gastriques 3,5 % Ulcères gastriques 2,2 % Polypes gastriques 2,2 % Polypes gastriques 0 % Ulcères duodénaux 0 % Ulcères duodénaux Sur 1246 patients infectés par H. pylori * 36 patients ont développé un cancer (2,9%)

20 Comment linfection par H. pylori conduit au cancer gastrique ? Processus très long (>40 ans) multifactoriel - mécanismes encore mal compris. H. pylori provoque une réponse inflammatoire chronique au niveau des cellules épithéliales de la muqueuse gastrique => conduit à des lésions de l'ADN (espèces réactives de l'oxygène et de l'azote). H. pylori provoque l'augmentation de l'enzyme AID, une cytidine deaminase responsable de l"editing" d'ADN => génère l'accumulation de mutations dans TP53. (Matsumoto et al. Nature Med 2007 ) L'infection par H. pylori diminue l'expression de certaines enzymes de réparation de l'ADN. (Machado et al, Clin. Canc Res 2009) H. pylori exprime des facteurs de virulence dont les activités augmentent le risque d'oncogenèse (VacA et CagA).

21 Activités de la cytotoxine VacA s1 s2 i1 i2 m1 m2 p33 p55 Formes plus fréquemment associées avec le cancer gastrique (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010) Séquence signal Domaine autotransporteur s i m Libération cytochrome C Vacuolisation Affaiblissement des jonctions intracellulaires Induction de l'apoptose Integrin ß2 Inhibition de l'activation et de la prolifération IL-2 Altération de la capacité à présenter les antigènes Activité immuno-suppressive : évasion de la réponse immunitaire adaptative Activité immuno-suppressive : évasion de la réponse immunitaire adaptative Macrophages Lymphocytes B Cellules T Inhibition de la fusion phagosome-lysosome

22 L'îlot de pathogénicité Cag cagA 30 gènes - Ilot Cag : acquis par transfert horizontal de gènes, présent dans : 50 % des souches européennes >95% des souches asiatiques - souches Cag + = facteur de risque pour le cancer gastrique : cancer => 95% Cag + gastrite non-atrophique => 40 % Cag + - Contient 22 gènes requis pour la synthèse d'un système de sécrétion de type IV (SST4) 40 kb Cellule épithéliale épithéliale H. pylori Membrane interne Membrane externe

23 H. pylori Cellule épithéliale CagA SST4 CagA, une molécule pro-oncogène injectée par le SST4 Cag récepteur intégrines 5 ß1 - Remaniement du cytosquelette - Remaniement du cytosquelette (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) - Prolifération cellulaire - Prolifération cellulaire - Remaniement du cytosquelette - Remaniement du cytosquelette (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) (augmentation de la mobilité et élongation cellulaire) - Prolifération cellulaire - Prolifération cellulaire CagA P SHP2 SRC ABL CagA P CSK fragments de PG Viala et al. Nature Immunol Activation de NF-kB => Stimulation de la transcription de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 Activation de NF-kB => Stimulation de la transcription de la cytokine pro-inflammatoire IL-8 Nod1 Perturbation - des jonctions serrées et adhérentes - de la polarité cellulaire Perturbation - des jonctions serrées et adhérentes - de la polarité cellulaire CagA JAM ZO-1 ß-catenin Activation anormale Hyperprolifération et différentiation aberrante (D'après Polk and Peek, Nature Reviews Cancer, 2010) Rôle du SST4 Cag dans la transformation des cellules épithéliales gastriques

24 Effet de léradication de H. pylori sur le développement du cancer gastrique Atrophie gastrique Amélioration dans l'antre et le corps Métaplasie intestinale Aucune amélioration Gastrite chronique Atrophie gastrique Métaplasie intestinale Dysplasie Adénocarcinome Gastrite chronique Atrophie gastrique Métaplasie intestinale Dysplasie Adénocarcinome Traitement du MALT: 80 % de régression après éradication de H. pylori Effet bénéfique de l'éradication de H. pylori sur l'évolution des lésions pré-néoplasiques (Méta-analyse par Rokkas et al. Helicobacter 2007) Point de non-retour ?

25 Helicobacter pylori : une bactérie de découverte récente responsable de diverses pathologies de l'estomac chez l'homme. H. pylori colonise de manière persistante la moitié de la population humaine mondiale ( morts/an). H. pylori = la seule bactérie reconnue comme oncogène de classe 1 (MALT et adénocarcinome). Adénocarcinome apparaît après des décades d'infection par H. pylori –mutagenèse de l'ADN des cellules hôtes (inflammation, AID). –diminution de l'expression de facteurs de réparation de l'ADN. –expression de facteurs de virulence (VacA et Cag) qui augmentent le risque d'oncogenèse. L'éradication de H. pylori fait régresser le MALT et elle est bénéfique pour l'évolution des lésions pré-oncogènes. Conclusions

26 H. pylori possède des propriétés uniques qui lui permettrent de survivre et de se multiplier à long terme dans lestomac, un organe pourtant hostile...

27 Barrière physique : mucus très épais Barrière biologique : réponse immunitaire Barrière chimique : acidité pH médian : 2 pH cellules épithéliales Adapté de Tortora, Funke and Case "Microbiology, an introduction" editeur Pearson pH neutre

28 Barrière immunologique Motifs Lewis : mimétisme moléculaire Immuno-suppression

29 Barrière physique : mucus très épais Forme spiralée pour pénétrer dans le mucus Flagelles pour se déplacer dans le mucus

30 2 NH 3 + CO 2 NH 4 + H+H+ H+H+ = O NH 2 -C-NH 2 + H 2 O H+H+ H+H+ H+H+ H+H+ Barrière chimique : pH très acide Uréase

31 Urease : un facteur de virulence majeur de H. pylori -Enzyme essentielle pour la résistance à l'acidité, indispensable à la colonisation de modèles animaux -Urease : 10% protéines totales de H. pylori -Uréase de H. pylori, la plus active de toutes les uréases décrites (Km=0,2-0,5 mM) -Au niveau des cellules épithéliales gastriques de l'hôte -l'ammoniac produit par H. pylori est cytotoxique -la présence d'ammoniac accélère l'induction de l'apoptose induite par la cytokine TNF

32 Ni nickel ions par complexe actif d'uréase [(UreA-UreB) 3 ] 4 Urease : une métalloenzyme à nickel

33 Ni 2+ Uréase : une arme à double tranchant - à pH acide : activité indispensable à la survie de H. pylori - à pH neutre : production d'ammoniac délétère car conduit à un pH alcalin toxique pour H. pylori

34 pH Compte-viable des bactéries PBS pH °C - 1 H PBS pH mM urée PBS pH mM urée 2x10 8 bact./ml H. pylori Tests de la réponse de H. pylori à l'acidité in vitro

35 pH = 7 pH = 2 1 H 10 8 CFU/ml pH = 2 pH finalpH initial Nécessité pour la bactérie de contrôler son activité uréase Incubation sans urée pH = 6.5 pH = 7 pH = 9 1 H 10 8 CFU/ml pH = 2 pH initialpH final Incubation avec urée Toxique

36 Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori -Accessibilité de son substrat, l'urée -Transport de son co-facteur, le nickel -Incorporation du nickel dans son site actif Identification de mécanismes originaux - Stockage du nickel

37 Sous-unités catalytiques Protéines accessoires ureAureBureI ureEureF ureGureH Ni 2+ UreHEFG (UreA-UreB) 6 P Canal à urée UreI H+H+ Urée Skouloubris et al. Infect & Immun 1998 Bury-Moné et al. Mol Microbiol 2001 et 2004 Construction d'un mutant de H. pylori ureI -> activité uréase identique à celle de la souche sauvage (sur des lysats)

38 pH = 6.5 pH = 7 pH = 9 1 H pH = 2.5 pH = CFU/ml 10 5 CFU/ml 1 H pH = 2 Souche de H. pylori sauvage Mutant de H. pylori ureI pH = 7 pH = 2 UreI est nécessaire pour la survie de H. pylori à pH acide en présence d'urée pH finalpH initialpH finalpH initial Incubation avec urée Démonstration du transport de l'urée à pH acide par UreI dans un système hétérologue (oocytes de Xénopes) Weeks et al. 2001

39 01234 semaines Inoculation par voie orogastrique de 10 9 bactéries (souche SS1) Compte-viable Sacrifice La protéine UreI est essentielle pour la colonisation d'un modèle animal par H. pylori

40 NH 3 + CO 2 UréaseUréase NH 4 + H+H+ Urée H+H+ H+H+ H+H+ UreI = canal à urée dans la membrane interne de la bactérie ouvert uniquement à pH acide (cible thérapeutique - brevet) UreI = canal à urée dans la membrane interne de la bactérie ouvert uniquement à pH acide (cible thérapeutique - brevet) H+H+ H+H+ H+H+ UreI H+H+ H+H+ H+H+

41 Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori -Accessibilité de son substrat, l'urée -Transport de son co-facteur, le nickel -Incorporation du nickel dans son site actif Identification de mécanismes originaux

42 Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se procurer du nickel dans lestomac de son hôte Il est essentiel pour Helicobacter pylori de se procurer du nickel dans lestomac de son hôte Nickel L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte est un élément de virulence L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte L'acquisition des métaux par les bactéries pathogènes au sein de leur hôte est un élément de virulence

43 Environnement gastrique : - complexe et varié - biodisponibilité des ions métalliques ? Concentration du nickel dans le corps humain est très faible : 2-11 nM Acquisition du nickel par H. pylori Ni 2+ NixA ? MI ME Comment le nickel est-il transporté à travers la membrane externe (ME) ? Aucune source d'énergie disponible au niveau de la ME

44 Modified from Braun & Braun Substrate-binding site Le complexe TonB/ExbB/ExbD fournit de l'énergie pour le transport à travers la membrane externe (ME) en utilisant la force proto-motrice de la membrane interne (MI) Substrats du système TonB : Fer chélaté (sidérophores) Cobalamin, vitamine B12 (cofacteur cobalt) Transporteur dépendant de TonB = TBDT ME MI

45 La machinerie ExbB/ExbD/TonB est impliquée dans le transport du fer chez H. pylori Kristine SCHAUER Question: est-ce que TonB est requis pour le transport énergisé du nickel ?

46 Mesures du contenu intracellulaire en nickel par la technique de "Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry" (ICP-MS) Ni 2+ pH 7 A pH 7, peu de nickel accumulé indépendamment de TonB µmol Ni 2+ /g prot A pH 5, augmentation de l'accumulation du nickel, dépend de TonB pH 5 mutant exbB-exbD-tonB + mutant complémenté

47 Modified from Braun & Braun Identification du transporteur TonB-dépendant présente les caractéristiques d'un TBDT localisée dans la membrane externe (Ernst et al J. Bact) régulée par NikR en réponse au nickel (Muller et al NAR) FrpB4 Mutant frpB4, même phénotype que le mutant exbB-D-tonB

48 Conséquences du transport du nickel TonB-dépendant sur l'activité uréase Conséquences du transport du nickel TonB-dépendant sur l'activité uréase pH 7pH 5 A pH 7, accumulation du nickel TonB-indépendante => activation de l'uréase A pH 5, à des faibles doses de nickel => Machinerie ExbB/ExbD/TonB + FrpB4 nécessaires à l'activité uréase

49 H+H+ PMF ExbB ExbD TonB FrpB4 H+H+ ME MI FrpB4 = Transporteur de nickel dépendant de TonB Transport de nickel est activé à pH acide Activation de l'uréase à pH acide par l'apport de nickel Schauer et al. Molec Microbiol (2007) NixA Nickel Schauer, Rodionov et al. TIBS (2008) Uréase Première démonstration d'un transport du nickel à travers la ME par un mécanisme dépendant de la machinerie TonB

50 Plusieurs niveaux de contrôle de l'activité uréase chez H. pylori -Accessibilité de son substrat, l'urée -Transport de son co-facteur, le nickel -Incorporation du nickel dans son site actif Identification de mécanismes originaux

51 Purification de complexes multi- protéiques à partir de l'organisme d'origine => Meilleure spécificité des complexes (moins de faux positifs) Purification de complexes protéiques par la technique TAP, Tandem Affinity Purification (Kerstin STINGL) Incorporation du nickel dans l'uréase par des complexes protéiques Carte génomique d'interaction protéiques par paires (Y2H) Nature (2001), Mol Microbiol (2001), NAR (2003)

52

53 Recherche de complexes protéiques associés à l'uréase chez H. pylori par TAP

54 Identification de deux populations de complexes - un complexe enzymatique actif associé à des enzymes du métabolisme de NH 3 - un complexe d'incorporation du nickel partagé avec celui de l'hydrogénase (distribution du nickel) Identification de deux populations de complexes - un complexe enzymatique actif associé à des enzymes du métabolisme de NH 3 - un complexe d'incorporation du nickel partagé avec celui de l'hydrogénase (distribution du nickel) Urease Ni 2+ Hydrogenase Complexes protéiques pour l'incorporation du nickel

55 UreaseUrease HydrogenaseHydrogenase Urée H+H+ UreI H+H+ Canal à urée activé à pH acide Urée NixA Nouveaux mécanismes pour l'acquisition du nickel, activés à bas pH FrpB4 TonB-ExBD Ni 2+

56 Helicobacter pylori est une bactérie fascinante ! - il reste beaucoup daspects de sa virulence à comprendre - elle constitue un bon système détude * pour identifier de nouveaux mécanismes ou de nouvelles fonctions dont certains peuvent être communs à dautres bactéries pathogènes * pour comprendre les processus qui conduisent au cancer

57 Pour en savoir plus sur H. pylori

58 Eliette TOUATI Valérie MICHEL Hilde DE REUSE Unité Pathogenèse de Helicobacter Julien GALLAUD Yulia REDKO Sylvie AUBERT Daniel VINELLA Julien FERNANDES Mécénat ODYSSEY-Re Janssen Karine ANGER ERL3526 Mireille FERRAND

59 Laboratoire de Chimie et Biologie des Métaux (CEA/CNRS Grenoble) Christelle BALHAWANE Isabelle MICHAUD-SORET Laboratoire de Cristallographie et Cristallogenèse des Protéines (CEA/CNRS Grenoble) Christine CAVAZZA Laboratoire CEA de Cadarache DSV/IBEB/SBVME/LB3M Pierre RICHAUD Groupe de Cristallographie Macromoléculaire (ESRF Grenoble), now at IBCP Lyon Cyril DIAN Laurent TERRADOT Génopole IP (Proteopole) Pascal LENORMAND Jean-Claude ROUSSELLE Abdelkader NAMANE Burnham Institute, La Jolla USA Dmitry RODIONOV

60 MERCI POUR VOTRE ATTENTION ! AVEZ-VOUS DES QUESTIONS ?


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