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Directeur de thèse : Pr. André GRAND Laboratoire Lésions des Acides Nucléiques Vanessa LABET Etude théorique de quelques aspects de la réactivité des bases.

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1 Directeur de thèse : Pr. André GRAND Laboratoire Lésions des Acides Nucléiques Vanessa LABET Etude théorique de quelques aspects de la réactivité des bases de lADN Définition de nouveaux outils détude de la réactivité chimique

2 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 2/42 08 septembre 2009 Plan 1.Problématique a.LADN b.Les lésions étudiées c.Cas particulier de la désamination spontanée de la cytosine 2.Outils a.Surface dénergie potentielle b.Indices de réactivité c.Profils de réaction d.Méthodes de calcul 3.Résultats a.Proposition dun mécanisme pour la désamination de la cytosine b.Rationalisation des différences de réactivité induites par des modifications structurales c.Etude des mécanismes concertés asynchrones 4.Conclusions et perspectives

3 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 3/42 08 septembre Problématique

4 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 4/42 08 septembre 2009 LADN adénine guaninethyminecytosine5-méthylcytosine Copyright © 1983 Scientific American, Inc. All rights reserved Bases :

5 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 5/42 08 septembre 2009 Lésions étudiées Désamination de la cytosine Dimères de bases pyrimidiques cytosineuracile dinucléoside 5-TT-3 cyclobutadipyrimidine pyrimidine (6-4) pyrimidone (hydrolyse) (photocycloaddition [2+2]) Pontage intrabrin (addition radicalaire) dinucléoside 5-GT-3 G^T

6 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 6/42 08 septembre 2009 Désamination spontanée de la cytosine M. Ehrlich et al., Bioscience Reports, 1986, 6, 387 S. Slae et R. Shapiro, J. Org. Chem., 1978, 43, 1721 T=37°C et pH=7,4 Cytosine (ADN simple brin) 5-méthylcytosine (ADN simple brin) 5,6-dihydrocytosine (base libre) x 4-5 x Données expérimentales T. Lindahl et B. Nyberg, Biochemistry, 1974, 13, 3405 L.A. Federico et al. Biochemistry, 1990, 29, 2532 A T=37°C et pH=7,4 Simple brin: A pH=7,4 Simple brin Double brin A T=80°C et pH=7,4 Simple brin nucléotide x 300 x 1,2

7 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 7/42 08 septembre Outils

8 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 8/42 08 septembre 2009 Outils Recherche du mécanisme réactionnel Exploration de la surface dénergie potentielle Rationalisation de la différence de réactivité Evaluation dindices de réactivité Etude plus approfondie du mécanisme Tracé de profils de réaction

9 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 9/42 08 septembre 2009 Exploration de la surface dénergie potentielle Recherche de points stationnaires Coordonnée interne 1 Coord. Int 2 V Approximation de Born-Oppenheimer Surface dénergie potentielle Théorie de létat de transition Méthodes statiques Analyse vibrationnelle Calcul de la coordonnée intrinsèque de réaction à partir des états de transition Extraction des grandeurs thermodynamiques dactivation et de réaction à T, p V R TS P

10 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 10/42 08 septembre 2009 Les indices de réactivité dits de la DFT conceptuelle potentiel chimique densité électronique dureté chimique fonction de Fukui hyperdureté descripteur dual propension du système à attirer les électrons à lui (électronégativité) richesse des sites réactionnels en électrons résistance du système à un transfert délectrons aptitude dun site à recevoir ou céder de la densité électronique prépondérance du caractère Nu ou E dun site Ensemble canonique noyau de polarisabilité

11 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 11/42 08 septembre 2009 Les indices de réactivité de la DFT conceptuelle potentiel chimique densité électronique dureté chimique fonction de Fukui hyperdureté descripteur dual indices globaux indices locaux indices non-locaux réactivité sélectivité Ensemble canonique noyau de polarisabilité

12 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 12/42 08 septembre 2009 Indices délectrophilie GlobalLocal Contrôle électrostatique Contrôle de transfert de charge Comparaison intramoléculaire Comparaison intermoléculaire (Parr et al., 1999) (Morell et al., 2005) (Ayers et al., 2007)

13 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 13/42 08 septembre 2009 Les profils de réaction Le profil de force sannule en R, TS et P 2 extrema permettant de définir les zones de R, TS et P R TSP Quantifier la part de lénergie dactivation qui sert à la réorganisation géométrique, et celle qui sert au transfert électronique proprement dit Activation : F 0 x x (Toro-Labbé, 1999) Force de réaction

14 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 14/42 08 septembre 2009 Les profils de réaction Dureté chimique R P TS Dureté chimiqueRésistance au transfert de charge Principe de Dureté Maximum (Pearson, 1987) max à R et P Corollaire : min à TS

15 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 15/42 08 septembre 2009 Méthodes de calcul Fonctionnelle hybride B3LYP (Becke 1993) Théorèmes de Hohenberg-Kohn (1964) DFT : Théorie de la Fonctionnelle de la Densité électronique Généralisation du principe variationnel la plus utilisée Base de Pople triple- Hydratation : PCM (continuum diélectrique) 6-311G(d,p) =78,39 (eau) Logiciel : Gaussian 03

16 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 16/42 08 septembre Résultats Désamination spontanée de la cytosine à pH neutre

17 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 17/42 08 septembre 2009 Mécanisme proposé dans la littérature Mécanisme de type S N Ar : addition - élimination étape cinétiquement déterminante B3LYP/6-31G(d) Calcul Expérience mécanisme à améliorer M.H. Almatarneh et al. J. Phys. Chem. A 2006, 110, 8227

18 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 18/42 08 septembre 2009 Mécanisme proposé Mécanisme de type S N Ar : addition - élimination 1. Addition Nucléophile Assistée 2. Protonation 3. Elimination 4. Déprotonation V. Labet et al., Theor. Chem. Acc. 2008, 120, 429 mouvement des électrons activation du cycle aromatique

19 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 19/42 08 septembre 2009 Identification de la forme réactive Forme réactive ξ La forme réactive est celle pour laquelle la force de réaction sannule Forme plus stable que la forme réactive (énergie en kJ/mol) plus tard

20 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 20/42 08 septembre 2009 Diagramme dénergie Addition Nu Protonation Elimination Déprotonation PCM/B3LYP/6-311G(d,p) T=298K Laddition nucléophile constitue létape cinétiquement déterminante (ECD) Cohérent avec les données cinétiques expérimentales : E a =117±4 kJ/mol La molécule deau assistante permet de diminuer considérablement la barrière dactivation à franchir

21 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 21/42 08 septembre 2009 Cytosines modifiées Théorie de lEtat de Transition (Eyring) : V. Labet et al. J. Phys. Chem. A, 2009, 113, ,4 5,9 28, Le mécanisme proposé pour la désamination spontanée de la cytosine en milieu neutre permet de reproduire la différence de réactivité des différentes formes de la cytosine. Données expérimentales à T=37°C : échelle logarithmique

22 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 22/42 08 septembre 2009 Cytosines modifiées Cytosine 1,290,910,71 5-méthylcytosine 1,220,740,84 5,6-dihydrocytosine 1,000,860,92 en eV ; en eV V. Labet et al. J. Phys. Chem. A, 2009, 113, 2524 Electrophilie GlobaleLocale Contrôle électrostatique Contrôle de transfert de charge charge ChelpG ; LA N est sous contrôle de transfert de charge. La 5-méthylcytosine et la 5,6-dihydrocytosine se désaminent plus vite que la cytosine car leur carbone C4 a un meilleur pouvoir électrophile.

23 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 23/42 08 septembre 2009 ECD* : des profils de réaction particuliers un épaulement avant létat de transition 4 extrema de force de réaction Energie potentielle VForce de réaction F = - dV/dξ V. Labet et al. J. Phys. Chem. A, 2008, 112, Différents des profils « universels » pour une étape élémentaire Profils types pour une étape élémentaire Profils ECD désamination énergie V force F *ECD : étape cinétiquement déterminante

24 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 24/42 08 septembre 2009 ECD : des profils de réaction particuliers minimum de dureté état de transition Apparente contradiction avec le Principe de Dureté Maximum V. Labet et al. J. Phys. Chem. A, 2008, 112, Profil type pour une étape élémentaire Profil ECD désamination minimum de dureté à létat de transition Dureté η TS

25 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 25/42 08 septembre 2009 Profils particuliers – origine : asynchronicité ? V. Labet et al., Theor. Chem. Acc. 2008, 120, 429 distances en Ǻ

26 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 26/42 08 septembre Résultats Lien profils de réaction particuliers Mécanismes concertés asynchrones Vérification sur un autre exemple

27 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 27/42 08 septembre 2009 Cycloaddition [2+2] Etat de transition à létat fondamental : TS1_TC Mécanisme Concerté Asynchrone C5-N4 : 1,485Å C6-C4 : 2,606Å DFT/B3LYP/6-31G(d,p) (vide) thymine à lextrémité 5 tautomère imine de la cytosine à lextrémité 3 formation dun cycle azétidine

28 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 28/42 08 septembre 2009 Profils de réaction Épaulement dénergie potentielle 4 extrema de force Intersection conique avant TS1_TC ? η min avant TS1_TC

29 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 29/42 08 septembre Résultats Mécanismes concertés asynchrones : support théorique

30 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 30/42 08 septembre 2009 Problématique Réaction chimique Élémentaire (1 seul état de transition) Par étapes (succession de réactions élémentaires) Processus primitif Processus concerté (plusieurs processus primitifs) SynchroneAsynchrone Quel sens physique pour létat de transition dun mécanisme concerté asynchrone ?

31 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 31/42 08 septembre 2009 Modélisation dun processus primitif Modèle qui permet de reproduire les profils « universels » dénergie potentielle et de force de réaction pour une étape élémentaire VRVR

32 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 32/42 08 septembre 2009 Cas de 2 processus primitifs étape élémentaire (mécanisme concerté) étapes élémentaires successives étape élémentaire (mécanisme concerté) 2 processus asynchrones : profils profils universels = + = + Energie V Force F

33 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 33/42 08 septembre 2009 Mécanisme concerté asynchrone Processus 1 en phase de relaxation Processus 2 en phase dactivation Energie nécessaire au processus 2 grâce au processus 1 Energie nécessaire au processus 2 sans le processus 1 < Lasynchronicité des 2 processus primitifs rend le mécanisme plus facile

34 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 34/42 08 septembre 2009 Cas de 2 processus primitifs Et pour la dureté ? hypothèse : Le Principe de Dureté Maximum est valable pour les processus primitifs approximation : approximation harmonique au voisinage de ξ TS1 et ξ TS2 max àmin à etmax àetmin à

35 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 35/42 08 septembre 2009 Cas de 2 processus primitifs Et pour la dureté ? état de transition apparent du mécanisme concerté minimum de dureté du mécanisme concerté vrai seulement si les deux processus sont de même nature Si lhypothèse de départ est valable, il ny a aucune raison théorique pour que le Principe de Dureté Maximum soit vérifié dans le cas dun mécanisme concerté asynchrone vrai seulement si les 2 processus sont synchrones

36 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 36/42 08 septembre 2009 Elément en faveur de lhypothèse Comment valider lhypothèse de départ ? Montrer que pour un processus primitif, la position de létat de transition est indépendante du nombre délectrons dans le système A.K. Chandra et T. Uchimaru, J. Phys. Chem. A, 2001, 105, 3578 Vrai si : Rappel : Validité Principe de Dureté Maximum

37 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 37/42 08 septembre 2009 Elément en faveur de lhypothèse Le mécanisme concerté semble pouvoir être décomposé en 3 processus primitifs La position des états de transition de ces 3 processus semble indépendante du nombre délectrons Cas de lECD de la désamination de la cytosine élément en faveur de lhypothèse processus 1 E a lorsque N processus 3 E a lorsque N Nature électrophile / nucléophile des attaques subies par le substrat

38 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 38/42 08 septembre Conclusions et perspectives

39 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 39/42 08 septembre 2009 Conclusions Désamination de la cytosine Proposition dun mécanisme réactionnel en accord avec les données expérimentales : Type addition-élimination Etape-clé : addition nucléophile dune molécule deau assistée par une seconde molécule deau Rationalisation de la différence de réactivité entre la cytosine, la 5-méthylcytosine et la 5,6- dihydrocytosine : Laddition nucléophile assistée est sous contrôle de transfert de charge La méthylation en C5 et la saturation de la double liaison C5-C6, bien que diminuant lélectrophilie globale de la cytosine, augmentent le pouvoir électrophile local du carbone C4 subissant lattaque nucléophile Pourquoi la 5-méthyl-5,6-dihydrocytosine se désamine-t-elle moins vite que la 5,6-dihydrocytosine ?

40 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 40/42 08 septembre 2009 Conclusions Mécanismes concertés asynchrones Des particularités dans les profils de réaction peuvent permettre didentifier un mécanisme concerté asynchrone : épaulement dénergie potentielle force de réaction avec plus de 2 extrema minimum de dureté ne coïncidant pas avec létat de transition. Létat de transition dun mécanisme concerté asynchrone est un état de transition apparent dont la signification physique nest pas la même que celui dun processus primitif. Non respect du Principe de Dureté Maximum Létude du profil dénergie potentielle en fonction du nombre délectrons peut permettre didentifier le nombre de processus primitifs impliqué dans un mécanisme concerté asynchrone de connaître la nature Nu / E de ces processus A vérifier sur dautres exemples : cycloadditions avec substituants ?

41 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 41/42 08 septembre 2009 Conclusion générale et perspectives Au cours de ce travail : utilisation complémentaire de méthodes quantitatives et qualitatives pour obtenir des informations sur des réactions chimiques particulières définition de nouveaux outils conceptuels détude de la réactivité chimique Perspectives développer ces nouveaux outils vérifier leur pertinence

42 Vanessa Labet – Soutenance de thèse 42/42 08 septembre 2009 Pr. André GrandDr. Christophe Morell


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