La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas."— Transcription de la présentation:

1 Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas Laboratoire de Physique et M. Christophe Place Laboratoire transdisciplinaire Joliot-Curie

2 MODIFICATION DE LORGANISATION SPATIALE ET TEMPORELLE DU NOYAU = MODIFICATION DE LETAT CELLULAIRE Dynamique interne du noyau dune cellule vivante. Dynamique interne du noyau dune cellule vivante. CELLULE : unité de structure fondamentale de la plupart des organismes vivants. 2 types de cellules: Procaryotes : sans noyau (bactéries,…) Eucaryotes : disposant dun noyau (hommes, animaux, plantes,…) Noyau : délimité par la membrane nucléaire Noyau contient ADN, support information génétique. Découverte récente : grande organisation structurelle et dynamique

3 Microscopies -> vision globale de la structure, développer une technique -> approche globale de la dynamique interne du noyau Dynamique interne du noyau dune cellule vivante. Dynamique interne du noyau dune cellule vivante. Projet : étudier la dynamique du noyau dune cellule vivante par : Diffusion Dynamique de la Lumière. Idée : mesurer les fluctuations; en sortir des informations sur lensemble des propriétés dynamiques internes

4 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

5 Contient ADN sous forme compactée : la chromatine Molécule dADN + protéines (histones, …) CHROMATINE Unité de base : nucléosome 1) Le noyau I> Introduction

6 Territoires chromosomiques 1) Le noyau Répartition de la chromatine dans le noyau non aléatoire : dans territoires chromosomiques (Manuelidis, 1985 et 1990) Reconstruction en 3D de la répartition des territoires chromosomiques dans le noyau dun fibroblaste (Bolzer et al., 2005) I> Introduction

7 Territoires chromosomiques entourés par espace interchromosomique (Cremer et Cremer, 2001) : éléments nécessaires à lexpression des gènes et à la réplication de lADN Espace interchromosomique Corps nucléaires Protéines Polymérases ARN Nucléotides Territoires chromosomiques Chromatine I> Introduction 1) Le noyau Pores nucléaire

8 Mouvement des territoires chromosomiques dans le noyau. ( Belmont, 2001) Dans territoires chromosomiques : Mouvement de la chromatine à lintérieur du territoire chromosomique. (Belmont et al., 2001, 2003). Changement de « structure » de la chromatine : Décondensation et condensation de la chromatine pour permettre la transcription, la réplication et les réparations de lADN. Dans espace interchromosomique : Mouvement de diffusion des protéines et des complexes ARN-protéines à lintérieur du noyau : Mesure du coefficient de diffusion D de ces « objets » : m 2.s -1 D m 2.s -1 ; (Shav-Tal et al., 2004). Réactions biochimiques. I> Introduction 2) Dynamique du noyau

9 I> Introduction 2) Dynamique du noyau BIOLOGIEPHYSIQUE ChromatinePolymère ProtéinesParticules colloïdales Noyau => Système hors équilibre car système actif : activité biochimique continuelle ; en permanence réactions chimiques consommant de lénergie et produisant de la chaleur (en particulier, synthèse de lARN : transcription, et de lADN : réplication). Technique physique adaptée pour analyse dynamique polymères, particules colloïdales : DIFFUSION DYNAMIQUE DE LA LUMIÈRE

10 Technique sensible aux variations spatio-temporelles n(r,t) de lindice de réfraction n du milieu traversé par la lumière. i.e. de la composition, de la concentration, de lorganisation du milieu. I> Introduction 3) Diffusion dynamique de la lumière POUR NOYAU : mouvements et changements de structure de la chromatine, diffusion des complexes de macromolécules, réactions biochimiques. DDL :

11 Analyse des variations temporelles de lintensité de la lumière diffusée par le noyau au cours dun processus particulier : le cycle cellulaire Information globale sur la dynamique du noyau Avantages de la DDL pour la dynamique du noyau : Mesures globales ; pas uniquement informations sur « objets » fluorescents. Mesure physique non-invasive et non-destructrice pour la cellule, contrairement aux expériences de fluorescence ; si bon choix de la longueur donde et de la puissance. Temps caractéristiques accessibles de s à 10 s et, échelle de lordre de quelques 500 nm. I> Introduction 4) DDL par le noyau dune cellule vivante DDL

12 Cycle cellulaire, 4 phases différentes : G1, S, G2 et M. I> Introduction 4) DDL par le noyau dune cellule vivante Phénomène fondamental : le cycle cellulaire Effet du cycle cellulaire sur la dynamique interne du noyau ? Assemble le fuseau mitotique, prépare la cellule à la mitose Termine la division cellulaire Déclenche lanaphase et conduit à la cytodiérèse Déclenche la machinerie de réplication de lADN; Réplique lADN

13 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

14 II> Montage expérimental et protocoles 1) Principe du montage expérimental Cellules immobiles car adhérentes

15 2 types de contraintes expérimentales à satisfaire : Contrainte « physiologique » : Environnement physiologique des cellules doit permettre développement normal des cellules pendant les expériences (de quelques heures à quelques jours). Contraintes « optiques » : a)Viser le noyau dune cellule b) Focaliser le faisceau laser sur le noyau dune cellule (5 m diamètre noyau 10 m). c) Faire limage du volume illuminé par le laser sur un détecteur. II> Montage expérimental et protocoles 1) Principe du montage expérimental

16 Cellules dans milieu de culture DMEM avec HEPES (pour préserver le pH). 1°) Chambre de culture placée horizontalement dans incubateur ; adhésion des cellules sur lamelle inférieure en 3 heures 2°) Chambre de culture placée, verticalement, dans « étau » thermostaté. II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture

17 Cellules SHEP visualisées 48h après introduction dans chambre de culture A t=0, confluence = 1/3 Objectif x10 Excellente survie et prolifération des cellules II> Montage expérimental et protocoles 2) Contrainte « physiologique » : chambre de culture 20 µm

18 II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » Diamètre noyau 6-7 µm focalisation faisceau laser avec objectif microscope. Recueillir lumière diffusée selon plusieurs angles : -> Montage à lhorizontal, -> Diffusion de la lumière « vers lavant ».

19 Noyau Laser II> Montage expérimental et protocoles 3) Contraintes « optiques » Puissance irradiation 0,1 - 0,5 mW Angle de diffusion variable

20 Dans la cellule. I(noyau) = u. a I(cyto.) = 5-20 u. a Dans le milieu. I = 1-2 u. a. II> Montage expérimental et protocoles 4) Validation du montage Mesures sur différents systèmes : 1)Mesures sur sphères de latex diluées ( 220 nm) avec focalisation laser à 1-2 m de la parois : beaux signaux mono-exponentiels ; Diffusion homodyne. 2) Fonctions dauto-corrélation mesurées pour différentes positions de focalisation du laser

21 SHEP : Neuroblastes (précurseurs des neurones) cancéreux. SHEP ? Adhérentes, gros noyau, cycle cellulaire continu et régulier (durée = 15 heures), … Aussi culture simple, « robustes ». Pour notre étude : cellules neuroblastomes de la lignée SHEP II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes

22 Population « normale » de SHEP : Problème : synchroniser les cellules dans le cycle pour connaître la phase du cycle des cellules à linstant de la mesure. Blocage des cellules en fin de G1 par utilisation de HU. (HU : Hydroxyurée Molécule à effet cytobloquant ; empêche la cellule dentrer en phase S) Puis redémarrage synchronisé (« en phase ») après élimination de HU. II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes 60 % G0/1 15 % S 25 % G 2 +M

23 Etudier effet HU sur le cycle cellulaire des SHEP par cytométrie en flux MAIS Cytométrie en flux sur cellules en boîte de Pétri dans incubateur CO 2 Conditions différentes de notre montage : lame de verre, sans CO 2 Etude par expériences de cytométrie en flux En parallèle Observations visuelles déchantillons placés dans le montage II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes

24 Détermination de la proportion de cellules dans chaque phase du cycle cellulaire par cytométrie en flux Un intercalant fluorescent de lADN est ajouté à une suspension « cellulaire ». Les cellules sont irradiées par un laser qui excite le colorant. Lintensité de fluorescence émise par le noyau est mesurée. La cytométrie en flux permet de déterminer la « quantité » dADN présente dans la cellule II> Montage expérimental et protocoles 5) Etude du cycle cellulaire de neuroblastomes Pic G0/1 Pic G2+M Phase S Intensité fluorescence Contenu en ADN Nombre de cellules

25 Pas de mitose Par cytométrie en fluxDans le montageElimination HU Non éliminé 48 heures

26 Pas de mitose Par cytométrie en fluxDans le montageElimination HU Non éliminé 48 heures Eliminé après 10 heures (t 0 ) 80% des cellules entrent en mitose à t heures

27 Pas de mitose Par cytométrie en fluxDans le montageElimination HU Non éliminé 48 heures Eliminé après 15 heures (t 0 ) 80% des cellules entrent en mitose entre t 0 +9 et t heures

28 HU éliminé après 10 heuresHU éliminé après 15 heures Mesures S Mesures G2 Mesures M Mesures G0/1

29 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

30 Signal non stationnaire : Modulations sur temps longs (plusieurs dizaines de secondes) Variations brutales dintensité (toutes les 7-8 s) Fluctuations III> Résultats Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes

31 Fonction dauto-corrélation mesurée à = 21°. III> Résultats Principe autocorrélation : comparer fonction avec une version décalée delle même en temps.

32 Fonction dauto-corrélation mesurée à = 21°. III> Résultats 2 temps caractéristiques Ajustement par fonction : (A 1.exp(-(t/ 1 ) ) + A 2.exp(-t/ 2 )) 2 + B. ( )

33 Premières observations : Variations importantes de. A 2 > A 1 ; A 1 de 5 à 25 % de lamplitude du signal dynamique. Pas de corrélation entre et 1, ou 2. Pas de corrélation entre A 1 et 1, ni entre A 2 et 2. Pas de corrélation entre 1 et 2 ; processus de relaxation indépendants. 0,4 1 ; pas de corrélation entre et 1. III> Résultats

34 III> Résultats : temps 1 (qualitatif)

35

36

37 Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10 -3 s] Pics [10 -3 s] G0/1 (182/24) ; 40; (55) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

38 Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10 -3 s] Pics [10 -3 s] G0/1 (182/24) ; 40; (55) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

39 Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10 -3 s] Pics [10 -3 s] G0/1 (182/24) ; 40; (55) S (252/44) ; (15); (35-40) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

40 Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10 -3 s] Pics [10 -3 s] G0/1 (182/24) ; 40; (55) S (252/44) ; (15); (35-40) G2 (138/18) ; 25 III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

41 Phase CC (nb mes/nb de noyaux) Echelle Valeurs [10 -3 s] Pics [10 -3 s] G0/1 (182/24) ; 40; (55) S (252/34) ; (15); (35-40) G2 (138/18) ; 25 M (42/6) III> Résultats : temps 1 (quantitatif)

42 Dynamique complexe : Pour toutes les phases distributions différentes certainement dues à différents processus biologiques. 1 plus court plus on avance dans le cycle cellulaire. Relaxation rapide associée à exponentielle étirée (0,4 < => Distribution large de temps caractéristiques Explication possible : Nombreux processus dans le noyau = succession de processus hiérarchisés avec temps caractéristiques différents : analogie possible avec le « vieillissement » (Castaing et Souletie, 1991). => Distribution log-normale des temps de relaxation 1 et liés à la moyenne et à lécart type de la distribution A lheure actuelle, pas de lien entre les distributions de 1 et un, ou plusieurs, processus biologiques III> Résultats : temps 1

43 Phase CC Echelle Valeurs [s] Pics [s] G0/10,2-20,5 S0,2-1,20,45 G20,5-20,75; (1,5-2) M0,3-10,75 III> Résultats : temps 2

44 Estimation temps de relaxation lent peu précise <= problème estimation ligne de base Néanmoins : Pour toutes les phases, distribution ajustable par loi log-normale. Différences entre les distributions de chaque phase : différences moins prononcées que pour 1. Origines possibles de ce temps de relaxation : Diffusion de complexes ARN-Protéines : m 2.s -1 D m 2.s -1 (Shav-Tal et al., 2004). temps de relaxation, 1/Dq 2 (avec q vecteur donde ; dépend de langle de diffusion). Ici : q 2 2, m -2 => dans la gamme : 0,5 - 4 sec. Mouvement de la chromatine à lintérieur des territoires chromosomiques (Levi et al., 2005) ; temps de relaxation attendus : ~ la seconde. III> Résultats : temps 2

45 Plan I> INTRODUCTION II> MONTAGE EXPERIMENTAL ET PROTOCOLES III> RESULTATS IV> CONCLUSIONS-PERSPECTIVES

46 1) Conclusions DDL V> Conclusions et perspectives Mise au point dun montage expérimental original et protocoles Dynamique complexe : plusieurs temps caractéristiques, de quelques ms à plusieurs dizaines de secondes Analyse par autocorrélation 2 temps caractéristiques indépendants Temps rapide : quelques dizaines de millisecondes, distribution très différente selon phase du cycle cellulaire, signature de relaxations seffectuant par un ensemble de processus hiérarchisés Temps lent : de lordre de la seconde distributions changent légèrement au cours du cycle cellulaire gamme de temps compatible avec résultats sur diffusion de complexes ARN-protéines dans le noyau.

47 Travailler sur le signal brut de lintensité diffusée. Trouver des liens entre la dynamique du noyau et des processus biologiques. Utilisation dagents pharmacologiques pour bloquer des processus bien particuliers et analyser la nouvelle dynamique Coupler les mesures de diffusion avec des mesures de fluorescence Lien entre dynamique et activité biochimique. Mesurer la dynamique sur dautres systèmes : apoptose, autres lignées cellulaires que les SHEP, à lintérieur du cytoplasme. 3) Perspectives DDL V> Conclusions et perspectives

48 Phénomène inattendu : quand une cellule entre en apoptose après avoir été irradiée, plusieurs voisines entrent également en apoptose V> Conclusions et perspectives

49 Etude du mode de transmission de la mort par apoptose.

50 Contact ou diffusion ? Séparation des cellules grâce à des motifs carrés 50 µm 250 µm Objectif x10Objectif x40 V> Conclusions et perspectives

51 REMERCIEMENTS Equipe E. Goillot : support pour partie bio M. B. Berge : idée originale M. J.F. Palierne : aide pour acquisition du signal M. P. Borgnat : aide pour traitement du signal Mme M. Barbi : démarrage de lexpérience

52 Evolution de la distribution des temps caractéristiques en fonction de langle de diffusion

53 Evolution de la distribution des temps caractéristiques en fonction de langle de diffusion

54 Evolution de la distribution du coefficient détirement au cours du cycle cellulaire

55 Evolution de la distribution de au cours du cycle cellulaire

56 Fonction dautocorrélation de lintensité de la lumière diffusée par le cytoplasme dune cellule en phase G1 (ajustement par cumulants) 1 seul temps caractéristique « lent » entre : 0,1 s et 5 s


Télécharger ppt "Dynamique interne du noyau dune cellule vivante : étude par diffusion dynamique de la lumière Michaël Suissa Sous la direction de : M. Eric Freyssingeas."

Présentations similaires


Annonces Google