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ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578.

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1 ETUDE DES ALTERATIONS EPIGENETIQUES DES TUMEURS DES ENFANTS : LE CAS DES EPENDYMOMES ET DES NEUROBLASTOMES Thèse réalisée au sein de Unité INSERM U578 et du Service de Pédiatrie, CHU de Grenoble

2 Exposé La cytogénétique et l’épigénétique des cancers
La méthylation des gènes suppresseurs de tumeur et les méthodes d’étude Les épendymomes de l’enfant Les neuroblastomes de l’enfant Conclusions et Perspectives Deroulement de mon exposé

3 La génétique et les cancers
Le cancer est une maladie génétique acquise Altération au niveau de gènes suppresseurs de tumeur (GSTs) et oncogènes Altérations inactivatrices Délétion Mutation Translocation Hypothèse de Knudson Sélection d’un clone plus robuste Avantage prolifératif Les altérations inactivatrices sont récessives. Il faut une inactivation des deux allèles pour que la perte de fonction puisse être complète et effective, c’est l'hypothèse de « two-hit » de Knudson (Knudson 2000). Expliquer!!! Plus récemment, il a été montré que des tumeurs peuvent avoir une mutation d’un des deux allèles et que l’autre allèle peut être inactivé par une modification épigénétique (Myöhänen, 1998).

4 L’épigénétique Altérations qui Deux modifications principales:
ne changent pas la séquence de l’ADN sont transmises au cours des divisions cellulaires sont potentiellement réversibles. Deux modifications principales: Acétylation et méthylation des histones Méthylation de l’ADN La methylation de l’ADN est la modification qui a lieu le plus fréquemment dans l’ADN humain

5 La méthylation de l’ADN
Définition: L’addition d’un groupement méthyl au niveau du carbone 5 d’une cytosine dans un dinucléotide CpG Les méthyltransférases (DNMT1, DNMT3a et DNMT3b) La première methyltransferase identifiée, qui fonctionne basiquement dans le maintien de la methylation de l’ADN pendant la synthèse du nouveau ADN pendant la division cellulaire a été DNMT1 Après deux autres enzymes, DNMT3a and 3b, ont été clonées. Elles semble fonctionner plutôt comme des metyltransferases de novo. (pas de préference pour l’ADN hemi-methylé) Cytosine N NH2 O C CH3 5-mC 5-méthyl Cytosine N NH2 O C Démethylase S-adenosylhomocysteine ADN Méthyltrasferase S-adenosylmethionine

6 La méthylation de l’ADN
Les dinucléotides CpG sont peu fréquents dans l’ADN sauf dans les « îlots »CpGs Plus grande part des « îlots » sont retrouvés dans la région promotrice des gènes La méthylation pourrait entraîner la répression de la transcription de l’ADN deux mécanismes possibles En général, les dinucléotides CpG sont peu fréquents dans le génome des mammifères sauf dans des petites régions d’approximativement 1000 paires de base appelées « îlots » CpG. La plus grande partie des îlots CpG sont retrouvés dans la région promotrice de presque la moitié des gènes. Deux mécanismes sont proposé de inhibition de la transcription: La methylation de l’ADN empeche l’action des facteurs de transcriptions La methylation entraine un changement au niveau des histones que, à son tour, empeche la liaison des facteurs de transcription.

7 Mécanisme 1: la région promotrice
Cytosine non méthylée Cytosine méthylée Promoteur Séquence codante Facteurs de transcription Expliquer chaque chose dans chaque diapo… Représentation schematique de l’effet de la methylation des îlots CpG dans la région promotrice des gènes suppresseurs de tumeur

8 Mécanisme 2: l’acétylation des histones
Histone déacétylée Histone Histone acétylée CpG non méthylée CpG méthylée Expliquer !!! a. Chromatine non condensée b. Chromatine condensée La méthylation de l’ADN entraine la liaison d’une famille de proteines connues comme « methyl-binding domain » (MBD) proteines. Les membres de cette famille ont la proprieté de se lier specifiquement à l’ADN qui contient des sites CpGs. Au moins 3 des 5 membres de cette famille (MeCP2, MBD2, MBD3) sont associés à des complexes de proteines qui contiennent des histone deacetylases (HDAC1 and HDAC2) Donc, la méthylation de l’ADN a une influence directe dans l’acetylation des hystones et dans la structure de la chromatine, resultant dans la compactation de la chromatine qui est refractoire à la transcription. Il a été aussi proposé que la methylation de l’ADN pourrait entrainer un silence du gene par les proteines MBD qui recruitent les methylases des hystones (HMTs).

9 Méthylation et les processus physiologiques
Rôle important dans l’embryogenèse 4-6% de toutes les cytosines sont méthylées chez l’adulte Fonction normale comme Inactivation des rétrotransposons Inactivation du X Empreinte parentale

10 Méthylation et carcinogenèse
Hypométhylation globale Inactivation des gènes suppresseurs de tumeur par hyperméthylation Nombreuses études dans les tumeurs de l’adulte

11 Intérêts de la méthylation
Compréhension des mécanismes du développement tumoral Cible thérapeutique Utilisation comme marqueur diagnostique et pronostique (suivi clinique)

12 Le profil de méthylation
Le gène ne doit pas être méthylé dans le tissu normal Un type histologique donné ne peut pas être caractérisé par la méthylation d’un seul gène Établissement difficile d’un profil spécifique d’une tumeur

13 Cancers de l’enfant et épigénétique

14 Les cancers de l’enfant
Rares Morbidité et mortalité élevées Caractéristiques particulières Histologie différente Comportement souvent très agressif Souvent bonne réponse au traitement Maladie du développement Altérations épigénétiques moins étudiées En fait, quand nous avons commencé nos études aucun étude n’avait été publié sur la méthylation dans les neuroblastomes et dans les ependymomes.

15 Epigénétique et tumeur solide de l’enfant
REFAIRE Dans un premier temps, plusieurs gènes ont été étudiés dans des séries des tumeurs pédiatriques et des lignées cellulaires avec pour objectif de caractériser les gènes d’intérêt dans ces pathologies (Harada, 2002 a et b)

16 Epigénétique et tumeurs solides de l’enfant
Rétinoblastome Rb1: rétinoblastomes unilateraux et sporadiques Zeschnigk et al., J Med Genet. 36:793-4, 1999. Ostéosarcome RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK, p16: 93% Hou et al, Cancer 106 :1602-9, 2006. Plus de travaux dans les hémopathies malignes RETINOBLASTOMA: Joseph et al. (2004) ont detecté une méthylation de Rb1 dans 6,6% de ces échantillons. Ces résultats sont similaires à ceux décrits par Sakai et al. (7%) et un peu inferieurs à ceux de Zeschnigk, 1999 (10%). Ces méthylations ne sont observées que dans les cas des rétinoblastomes unilatéraux et sporadiques MGMT. A notre connaissance, la seule étude est celle de Choy et collaborateurs qui a démontré que l’expression de MGMT était souvent absente dans les rétinoblastomes à cause de la méthylation de sa région promotrice (Choy, 2002). OSTÉOSARCOME: L’étude des 5 gènes (RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK, p16) permet d’identifier des anomalies dans 93% des tumeurs alors que l’analyse individuelle de chaque gène a donné des résultats positifs dans 15-83% des échantillons selon le gène analysé. Les auteurs suggèrent, donc, que la méthylation de plusieurs gènes pourrait être utilisée comme un biomarqueur de diagnostic et de suivi dans les ostéosarcomes (Hou, 2006).

17 Méthode d’étude: les gènes étudiés
19 gènes suppresseurs de tumeur : Gènes impliqués dans le cycle cellulaire (Rb1, p14 ARF, p15INK4b, p16INK4a) Gènes impliqués dans l’apoptose (RASSF1A, DAPK, CASP8, DRC1, DRC2, FLIP) Gènes de la réparation de l’ADN (MGMT) Gènes impliqués dans l’angiogenèse, adhésion cellulaire et le remodelage tissulaire (APC, ECAD, TIMP3) Autres (RAR b, FHIT, BLU, INI1, NF2) Aide par des études réalisés en parallèle par d’autres équipes Dans les épendymomes et les neuroblastomes

18 Méthode d’étude: les gènes étudiés
DAPK MGMT INI1 NF2 EP300 APC RB BLU FHIT P16 CH 22 dans le cas des ependymomes

19 Méthode d’étude « Methylation specific PCR » (MSP) réalisée en deux étapes: Traitement avec le bisulfite de sodium PCR avec des amorces spécifiques Pour étudier la présence de la 5methylcytosine comme montré avant….

20 Le traitement bisulfite
Échantillon d’ADN: 5’-CATGCGGTCGACGT-3’ Traitement Bisulfite: Toutes les cytosines non méthylées sont transformées en uraciles. ADN modifié: Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’ Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’ M Modification des cytosines non méthylées par le bisulfite de sodium en uracile. Information transformée en polymorphisme de séquence Analyse plus facile

21 Methylation-specific PCR
Echantillon non méthylé: 5’-UATGUGGTUGAUGT- 3’ Echantillon méthylé: 5’-UATGCGGTCGACGT- 3’ MSP avec les amorces Non methylé (U) et methylé (M) Amorce U: 3’- ATACACCAACTACA-5’ Amorce M: 3’-ATACGCCAGCTGCA-5’

22 Methylation-Specific PCR
Avantages: Sensible Facile Inconvénient: Non quantitative Dire le pourquoi!

23 Méthylation et épendymomes
20-25 minutos!!

24 Les épendymomes Troisième tumeur du SNC chez les enfants
Pas de marqueur biologique connu Facteurs pronostiques: âge et résection chirurgicale Pas de réponse à la radiothérapie et à la chimiothérapie

25 Ependymomes et cytogénétique
Perte du chromosome 22q dans 23% des cas Perte du chromosome 6q dans 15% des cas Gain du 1q (20%) et altération du 17p (rare) Mais 40% des ependymomes n’ont pas d’anomalie chromosomique Pas d’association avec survie ou réponse au traitement

26 Nos hypothèses Méthylation comme mécanisme d’inactivation des gènes localisés dans le bras long du chromosome 22 (INI1, NF2, TIMP3, EP300) Profil épigénétique particulier Relation entre la méthylation et la survie

27 Matériel 27 épendymomes intracrâniens 7 papillomes du plexus choroïde
3 cortex adultes Papillomes utilisés comme contrôle bénin Cortex comme contrôle total Tumeurs utilisés pour une étude par CGH de l’institut Gustave Roussy

28 Résultats 1. RASSF1A LE PLUS FREQUEMMENT METHYLE
PAS DE MÉTHYLATION DES GENES SUR LE CHROMOSOME 22 2. GENES METHYLES DANS LES TUMEURS BENIGNES LIÉS À L’APOPTOSE

29 Résultats Pas de relation avec la survie

30 Résultats

31 Discussion Peu d’études réalisées Différents gènes étudiés
Possibilité d’une relation avec l’âge du patient et la localisation tumorale Enfant ≠ adultes Intra-crâniennes ≠ rachidiennes Rôle de l’épigénétique dans l’épendymome

32 Discussion Les voies de l’apoptose Utilisation possible:
le diagnostic différentiel la détection précoce d’une rechute Autres gènes à étudier Études mélangeants adultes et enfants

33 Méthylation et neuroblastome
20-25 minutos!!

34 Les neuroblastomes Le neuroblastome est la tumeur extra crânienne solide la plus fréquente chez les enfants de moins de 5 ans La présentation clinique est très variable: de la régression spontanée à l’évolution métastatique rapide Degré de différentiation histopathologique et différentiation Influence de facteurs cliniques comme l’âge et des facteurs biologiques comme… MARCAR A PASSAGEM! 30-35 MIN.

35 Cytogénétique La ploïdie L’amplification de NMYC
La délétion du chromosome 1p et du 11q La trisomie du chromosome 17q

36 Classification des neuroblastomes

37 Nos hypothèses Méthylation : mécanisme d’oncogenèse dans les neuroblastomes Profil de méthylation caractéristique des neuroblastomes Profil particulier en fonction des différents stades cliniques Implication dans la régression spontanée des formes regressives et maturantes de NB

38 Matériel 45 tumeurs primitives 17 rechutes

39 Résultats RASSF1A : le gène le plus souvent methylé
Deux tumeurs étudiés au diagnostic et au moment de la rechute: même profil

40 Nombre moyen de gènes méthylés
Résultats Stade Nombre de patients (%) Ampl NMYC Nombre moyen de gènes méthylés CASP8 BLU 1 2 4s 7 (15) 12 (27.5) 3 (7.5) 1/22 1.95 2/22 3/22 3 4 6 (12.5) 17 (37.5) 10/23 3.3 14/23 11/23 Méthylation corrélée au stade clinique

41 Résultats Cohorte représentative: distribution des stades cliniques, frequence de la déletion de 1p etc.

42 Résultats METHYLATION OF TUMOR SUPPRESSOR GENES IN NEUROBLASTOMA: THE RASSF1A GENE IS ALMOST ALWAYS METHYLATED IN PRIMARY TUMORS. Pediatric Blood and Cancer En cours de soumission après revision du manuscrite.

43 Discussion CASP8 La voie TRAIL RASSF1
La méthylation inhibe l’expression du gène dans des lignées cellulaires Teitz et al., Nat Med 6:529–35, 2000. La voie TRAIL Différence de profil de méthylation entre les ganglioneuromes et les neuroblastomes Rétablissement de ces gènes après traitement avec des agents déméthylants Banelli et al., Cancer Lett 228:37-41, 2005. RASSF1 Méthylé dans 100% des lignées cellulaires Corrélation avec la méthylation de CASP8 Possibilité d’un sous-type de neuroblastome Yang et al., Clin Cancer Res 10: , 2004. Nos résultats sont en accord avec les résultats de la littérature car…

44 Conclusions et Perspectives

45 Conclusions Étude de la méthylation de l’ADN dans les épendymomes et les neuroblastomes Suggestion d’un profil spécifique Dans le cas des épendymomes: Altération épigénétique dans les voies d’apoptose présente dans les tumeurs bénignes (papillome du plexus choroïde) Dans le cas des neuroblastomes: Altérations liées au stade clinique dans les neuroblastomes Possibilité d’une relation avec l’évolution tumorale

46 Perspectives Plus grand nombre de tumeurs Autres tumeurs
Application de méthodes quantitatives ADN dans le sang et le liquide céphalorachidien Collaboration avec d’autres centres et comparaison avec les données cliniques et génétiques À court terme

47 Perspectives Méthylation comme marqueur diagnostique et/ou pronostique
Utilisation thérapeutique agents déméthylants association de la méthylation et la résistance au traitement À long terme

48 Remerciements

49 Remerciements Les directeurs de thèse: Les rapporteurs:
Mr Plantaz et Mme Favrot Les rapporteurs: Mr Chastagner et Mr Dellatre Mlle Florence de Fraipont Le gouvernement du Brésil (CNPq) “Ministère de la Science” Les techniciennes du laboratoire et l’UF Cancérologie et Biothérapie Le Service de Pédiatrie du CHU de Grenoble

50 LES QUESTIONS

51 TUMEUR CEREBRALES

52 LEUCEMIES Chez les adultes les méthylations plus fréquentes : p15INK4B et p16INK4A dans les LAL et LAM. Chez l’enfant: Beaucoup moins d’études Méthylation de p15 dans moins de 50% des LAL Méthylation de p16 m’est pas très important Réarrangement MLL lié aux LALs du jeune enfant et caractérisé par l’hyperméthylation et non trascription de FHIT Silencing by hypermethylation was observed in 40% of ALL cell lines and 27% of pediatric ALL samples [13], especially in hyperdiploid tumors. Stam et al[14] found it to be specific for MLL rearranged infant ALL, since 100% of MLL+ samples were hypermethylated and silenced for FHIT versus 60% in a mixed group of MLL- infant ALL and non-infant ALL. FHIT expression was inducible after treatment with the demethylating agent decitabine and over expression of FHIT induced apoptosis and leukemic cell death. These data suggest that FHIT acts as a tumor suppressor gene, and may be characteristic for certain ALL subgroups such as MLL+ infant ALL.

53 MÉTHODES QUANTITATIVES
Nous décrirons deux d’entre elles : l’analyse avec enzyme de restriction spécifique à la méthylation (MSRE) et la puce à ADN d’oligonucléotides spécifiques à la méthylation (MSO). Le premier type de méthode utilise les endonucléases de restriction sensibles à la méthylation. Par exemple, l’enzyme McrBC coupe l’ADN méthylé et pas le non méthylé. Le fractionnement en tailles différentes d’ADN digéré de cette manière avec cette enzyme va entraîner une sous-représentation des séquences méthylées d’ADN dans la fraction de haut poids moléculaires. L’hybridation « microarray » peut donc, être utilisée pour identifier les séquences qui étaient méthylées (Lippman, 2004). Une autre méthode complètement différente (MSO) utilise le traitement de l’ADN génomique avec le bisulfite de sodium. Les sondes sont des oligonucléotides qui peuvent discriminer les dinucléotides transformés et les non transformés, c’est à dire, entre les cytosines méthylées ou non méthylées d’un site spécifique. Des oligonucleotides spécifiques d’une région sont utilisés pour quantifier la modification C-T induite par le bisulfite dans cette région (Adorjan, 2002 ; Gitan, 2002) (Figure 7).

54 PUCES À ADN

55 Discussion Representation schematique des variations de la méthylation dans les tumeurs ependymales. CDK2A (p16): pas de difference craniocaudal n’a été observée. Tu du cervelet des adultes étaient plus méthylés que ce des enfants 2. CDK2B (p15): ependymomes extracraniens étaient plus fréquemment méthylés que les intracrâniens 3. p14: plus en intracrânien que extra. p16 p15 Rousseau et al.(2003) Neuropathology and Applied Neurobiology 29: 574–583

56 La méthylation et la chromatine
HMT Groupe Methyl Groupe Acétyl CpGs methylées Methyl binding proteins (a) Les CpGs methylées sont liées par la methyl-binding proteins (MBD), qui sollicite les deacetylases des histones (HDACs). (b) HDACs catalyse l’enlevement des groupes acetyl du bout amino des histones (c) Le recrutement des histones methylase (HMTs) entraine l’adition des groupes methyl à l’histone, qui sont donc reconnue par les silencers de la chromatine, induisant un état inactif.

57 Agents déméthylants Chromatin remodeling. Flowchart of interactions between histone acetylation and DNA methylation. Euchromatin can be converted to heterochromatin by histone deacetylation and DNA methylation. Histone acetylation and deacetylation are fluent states. DNA methylation is semi-permanent by lack of any (known) intracellular demethylating enzym. Therefore demethylation can only be induced by demethylating drugs. DNMT: DNA methyltransferases, MBD: Methyl-binding domain proteins, HDAC: histone deacetylases, HAT: histone acetyltransferases, HDACi: HDAC inhibitor

58 Agents déméthylants Réactivation des gènes hyperméthylés par ces composants in vitro Résultats cliniquement significatifs dans les myélodysplasies, leucémies aigues myéloïdes (LAM) et leucémies myéloïdes chroniques (LMC)


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