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Confinement moléculaire et organisation de la membrane des cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de fluorescence.

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Présentation au sujet: "Confinement moléculaire et organisation de la membrane des cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de fluorescence."— Transcription de la présentation:

1 Confinement moléculaire et organisation de la membrane des cellules vivantes: analyse de la diffusion par spectroscopie de corrélation de fluorescence Laure WAWREZINIECK École doctorale Sciences de la Vie et de la Santé, Université Aix-Marseille II Spécialité: Biologie des eucaryotes, option Immunologie Sous la direction de: Didier MARGUET, Centre dImmunologie de Marseille-Luminy Université Aix-Marseille II – CNRS – INSERM Pierre-François LENNE, Institut Fresnel Université Aix-Marseille III – CNRS Journée des doctorants – 17 déc 04 Centre dImmunologie de Marseille-Luminy bourse MENRT

2 la membrane cellulaire: une structure très complexe! organisation dynamique: étude de la diffusion différentes méthodes sont possibles: Suivi de particules uniques (SPT) Recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) Engelman, Nature, 2005 Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)

3 I. Modèles dorganisation compartimentée de la membrane cellulaire II. Un outil pour étudier la diffusion moléculaire: la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) III. FCS à rayon variable et lois de diffusion FCS Wawrezinieck et al, SPIE, 2004 Wawrezinieck et al., Biophys J, 2005 IV. Lois de diffusion FCS mesurées dans les cellules vivantes COS-7 et nature du confinement membranaire Lenne et al, EMBO J, 2006 V. Étude préliminaire de la réorganisation membranaire au cours de lactivation cellulaire

4 tiré de Singer & Nicolson, 1972 Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles dorganisation

5 Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles dorganisation animation réalisée par léquipe dA. Kusumi

6 Confinement moléculaire dans la membrane cellulaire Modèles dorganisation tiré de Jacobson et al., 1995 mise en contact rapide des différents acteurs dune réaction organisation non aléatoire et non uniforme de la membrane animation réalisée par léquipe dA. Kusumi

7 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Structure du réseau de microfilaments dactine 50 µ m 0,2 µm Image obtenue par microscopie confocale de fluorescence de cellules CEF après marquage par rhodamine- phalloïdine Wakatsuki et al., 2001 Image obtenue par microscopie électronique dans un lamellipode de fibroblaste REF-52 Svitkina et al., 1987

8 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Le réseau des microfilaments dactine: un obstacle à la diffusion des protéines transmembranaires équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par léquipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des protéines TfR dans les mailles du réseau dactine: taille des mailles: 260 nm temps moyen de confinement: 55 ms récepteur à la transferrine (TfR) Fujiwara et al., 2002

9 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les protéines ancrées au cytosquelette: un obstacle à la diffusion des phospholipides équipe de Kusumi Expériences de suivi de particules uniques par léquipe de Kusumi (cellules NRK): confinement transitoire des phospholipides DOPE : taille des mailles: 230 nm temps moyen de confinement: 11 ms Fujiwara et al., 2002

10 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou lipid rafts

11 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou lipid rafts pas dobservation directe (structures trop petites et trop nombreuses) « membrane rafts are small ( nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

12 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou lipid rafts Une définition biochimique: fractions de membranes résistantes à lextraction par des détergents non-ioniques tels que le Triton X-100 à 4°C (ou le Brij 98 à 37°C) microdomaines enrichis en sphingolipides, cholestérol et certaines protéines dans rafts hors rafts GFP-GPI « membrane rafts are small ( nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

13 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Les radeaux lipidiques ou lipid rafts Vers une définition physique ? utilisation des propriétés de diffusion différentes en présence et en labsence de microdomaines mesure de la diffusion par des méthodes optiques « membrane rafts are small ( nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes » (Pike, 2006)

14 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS: montage de microscopie de fluorescence laser miroir dichroïque objectif de microscope trou confocal filtre échantillon photodiode à avalanches I(t)I(t) autocorrélation volume confocal

15 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas dune molécule unique Fonction dautocorrélation: Intensité defluorescence I ( t ) temps t fluctuation de fluorescence

16 =1+ Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas dune molécule unique Fonction dautocorrélation: = 1 + aire relative de recouvrement Intensité defluorescence I ( t ) temps t fluctuation de fluorescence I(t)I(t) copies I(t+ ) recouvrement délai temps t Intensité defluorescence I ( t )

17 =1+ Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas dune molécule unique Fonction dautocorrélation: = 1 + aire relative de recouvrement Intensité defluorescence I ( t ) temps t fluctuation de fluorescence I(t)I(t) copies I(t+ ) recouvrement aire relative de recouvrement délai temps t Intensité defluorescence I ( t )

18 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Principe de la FCS: cas de plusieurs molécules Intensité de fluorescence (kHz) temps t (s) 10 5 délai τ (ms) fonction dautocorrélation g (2) ( τ ) temps de diffusion dans le volume confocal

19 Utilisation de la FCS pour létude de la diffusion Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS traditionnelle: temps de diffusion

20 Comment obtenir de nouvelles informations sur lorganisation membranaire? Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation temps de diffusion τ d aire du spot w 2 La FCS à rayon variable:

21 Comment obtenir de nouvelles informations sur lorganisation membranaire? Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation temps de diffusion τ d aire du spot w 2 La FCS à rayon variable:

22 Comment obtenir de nouvelles informations sur lorganisation membranaire? Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation temps de diffusion τ d aire du spot w 2 La FCS à rayon variable:

23 Comment obtenir de nouvelles informations sur lorganisation membranaire? Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation temps de diffusion τ d aire du spot w 2 La FCS à rayon variable: Loi de diffusion FCS

24 Comment obtenir de nouvelles informations sur lorganisation membranaire? Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation temps de diffusion τ d aire du spot w 2 La FCS à rayon variable: Loi de diffusion FCS temps de diffusion τ d aire du spot w 2

25 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation La FCS à différentes échelles spatiales Le diamètre du spot peut être réglé entre 0,4 et 1,0 µm

26 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7 selon axe z x intensité détectée (cps) cellule COS-7 30 μm x y z lamelle noyau volume confocal position (µm)

27 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Analogues lipidiques fluorescents et protéines de fusion utilisées dans les cellules COS-7 (1) glycérophospholipides: FL-PC et FL-PE (2) sphingolipides: FL-SM et FL-GM 1 (3) protéines ancrées GPI: GPI-GFP et Thy1-GFP (4) protéines transmembranaires: GFP-TfR et GFP-DPP IV

28 fonction dautocorrélation délai (ms) fonction dautocorrélation délai (ms) Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Mesures de FCS réalisées sur les cellules COS-7: étude de lautocorrélogramme GFP-TfRFL-GM 1 diffusion libre 2D τ diff Létude à une seule taille de volume confocal ne permet pas de conclure quant au type de diffusion

29 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS mesurées sur les cellules COS temps de diffusion (ms) waist 2 (x10 3 nm 2 ) FL-GM 1 GFP-TfR Quels types dorganisation de la membrane permettent dexpliquer de telles lois de diffusion?

30 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: modèles de diffusion diffusion libre aire du spot - w 2 temps de diffusion obstacles imperméables domaines isolés partage dynamique réseau

31 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Modèle de réseau P D micro 2r D out D in P in P out r Modèle des domaines isolés w

32 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: paramètres Force de confinement ( S conf ): Temps de confinement ( τ conf ): temps moyen mis par une molécule placée au centre du domaine pour en sortir r P avec : P : probabilité de sortie dun domaine r : rayon du domaine : longueur moyenne du pas élémentaire diff : temps de diffusion à travers le domaine A : constante

33 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats

34 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations du réseau: résultats si X c 2 >2: Grandes tailles de spots confocaux

35 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats

36 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations des domaines isolés: résultats : coefficient de partage t 0 : indice de confinement Grandes tailles de spots confocaux si X c 2 >10:

37 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Simulations: résumé des résultats Aires accessibles domaines isolés t 0 > 0 diffusion libre t 0 = 0 réseau t 0 < 0 0 réseau domaines isolés diffusion libre Aire du spot confocal temps de diffusion obstacles imperméables t 0 = 0

38 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Glycérophospholipides/Protéines ancrées GPI/Sphingolipides FL-PC: glycérophospholipide GFP-GPI: protéine ancrée GPI FL-G M1 : sphingolipide

39 Modification enzymatique de la membrane Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation cholestérol oxydase sphingomyélinase sphingomyéline

40 Modification enzymatique de la membrane Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation cholestérol oxydase (COase) cholestérol cholesténone sphingomyélinase (SMase) + sphingomyéline céramide

41 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Analogues lipidiques fluorescents: traitements enzymatiques sans traitement

42 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques mais pas dans les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques

43 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques Les glycérophospholipides, sphingolipides et protéines ancrées GFP ne sont pas sensibles au confinement par le réseau dactine Cyto D

44 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: lexemple de TfR control

45 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: lexemple de TfR control

46 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: lexemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM)

47 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protéines transmembranaires: lexemple de TfR control + cytochalasine D (2 μM) + cytochalasine D (10 μM)

48 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou les mailles du cytosquelette modif actine modif radeaux lipidiques modif actine + modif radeaux lipidiques

49 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire des protéines transmembranaires dans les radeaux lipidiques et dans les mailles du réseau dactine Cyto D

50 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Confinement transitoire dans les radeaux lipidiques et/ou dans les mailles du réseau dactine caractéristiques des mailles du réseau dactine: caractéristiques des domaines isolés: taille des mailles: 2r = 240 ± 60 nm conf de lordre de plusieurs dizaines ou centaines de ms structure dépendante de la température taille des domaines: r < 60 nm conf de lordre de plusieurs dizaines de ms structures indépendantes de la température

51 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Application à létude de lactivation des lymphocytes T Principe: mesures sur cellules Jurkat, dont on maîtrise lactivation par ajout dans le milieu de culture dun anticorps anti-CD3 humain Complexe TCR/CD3

52 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en labsence dactivation

53 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en labsence dactivation

54 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en labsence dactivation

55 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Temps de diffusion et lois de diffusion FCS au cours de lactivation Ajout de lanticorps

56 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation

57 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation

58 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation

59 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Comment expliquer la loi de diffusion FCS mesurée au pic dactivation ? loi de diffusion obtenue pour un confinement total dans un domaine de taille finie

60 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Proposition de modèle… activation

61 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Conclusion et perspectives… étude qualitative: distinction entre deux types de confinement étude quantitative: mesure du temps de confinement et estimation de la taille 1ère mise en évidence de lexistence des radeaux lipidiques dans les membranes de cellules vivantes au repos

62 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Conclusion et perspectives… travaux utilisant la technique développée dans cette thèse Fas/Fas ligand F. Conchonaud et L.W. travail en collaboration avec léquipe de A.-O. Hueber (Cahuzac et al, Blood, 2005) dans cellules T travail poursuivi par Y. Hamon Ras/EGFR F. Conchonaud nanotrous J. Wenger (Wenger et al, to be published) AkT R. Lasserre, F. Conchonaud et Y. Hamon NCam IBDM

63 Federico Belloni PhD PACA/Zeiss Fabien Conchonaud PhD Laure Wawrezinieck PhD Annie Boned Annemarie Lellouch Arnauld Sergé Didier Marguet Nadia Djaker PhD David Gachet PhD Patrick Ferrand Pierre-François Lenne Serge Monneret Jérôme Wenger Hervé Rigneault Un grand merci à: H. Qasmi et N. Bertaux pour les simulations N. Sandeau pour les calculs de volumes confocaux F. Conchonaud pour toutes les préparations de cellules et les mesures de FRAP O. Würtz et A. Boned pour la biochimie O. Hawchar et Y. Hamon et H-T He pour les mesures sur Jurkat et P-F Lenne, H. Rigneault et D. Marguet pour leur soutien sans faille

64 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Quelques tests supplémentaires pour vérifier nos résultats expérimentaux mesures de FRAP: mesures de photoblanchiment: mesure de la fraction mobile: >95% des analogues lipidiques fluorescents sont mobiles >75% des protéines marquées par la GFP sont mobiles choix de la puissance dexcitation : compromis puissance suffisante pour avoir un bon rapport signal sur bruit puissance suffisamment faible pour pouvoir négliger le photoblanchiment les lois de diffusion FCS mesurées décrivent correctement le comportement des molécules marquées

65 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Structure et rôle du complexe TCR/CD3-

66 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en labsence dactivation

67 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Protocole détude de la réorganisation membranaire au cours de lactivation Protocole: Placement du volume confocal sur la membrane Addition antigène anti-CD3 humain 30 s après ajout: début des mesures 10 min découpés en runs de 5 s Regroupement des mesures en tranches de 1 min

68 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS dans les cellules Jurkat en labsence dactivation/au pic dactivation

69 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation mesures prises à t<0 (plein) et t [3;4] min (creux)

70 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation mesures prises à t<0 (plein) et t [3;4] min (creux)

71 Modèles dorganisation FCS Lois de diffusion FCS Nature du confinement Activation Lois de diffusion FCS en absence/lors du pic dactivation mesures prises à t<0 (plein) et t [3;4] min (creux)


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