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Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche deffecteurs Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA.

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1 Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche deffecteurs Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron

2 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

3 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

4 Le cytosquelette microtubulaire Interphase Mitose

5 Structure des microtubules

6 Assemblage des microtubules Lassemblage est réversible, nécessite de lénergie, atteint un état stationnaire hors déquilibre Eléments requis : Concentration critique, température minimale Source dénergie: GTP Solution adéquate (tampon, magnésium)

7 Nucléation des microtubules DIMERESOligomères FeuilletsMICROTUBULES

8 Elongation des microtubules Addition de dimères Elongation de feuillets

9 Instabilité dynamique Etat stationnaire Consommation dénergie à létat stationnaire Consommation dénergie à létat stationnaire Flux de sous-unités Longueur (µm) Temps (s) Treadmilling +-

10 Dynamique des microtubules in vivo Interphase Mitose Une architecture dynamique Une architecture dynamique Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire Renouvellement permanent des microtubules Instabilité dynamique « tempérée » Treadmilling

11 Contrôle de la stabilité des microtubules Protéines stabilisant les microtubules MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4 Lis1, Doublecortine XMAP230, XMAP215, TOGp STOP Intégrateurs du cytosquelette Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments) MACF (microtubules, actine) Protéines déstabilisantes Stathmine, SCG10 XKCM1, Kar3p Rev

12 Modulation du turnover des microtubules Protéines liant lextrémité plus des microtubules Bim1, EB1, EB2 Tip1p

13 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

14 Objectifs êRéévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules êObtention et caractérisation doligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules êRecherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules

15 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

16 Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules Mise au point de dosages Mesure simultanée de Mesure simultanée de - concentration en tubuline-GTP - « masse » de tubuline assemblée - distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne [Tubuline-GTP](t) [Tubuline-GTP](t) m(t) m(t) l(t) l(t) [MT](t) [MT](t) Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP Pas de système régénérateur du GTP la tubuline nassemble quune seule fois

17 Réactions dassemblages Vitesse et amplitude augmentent Symétrie des courbes Désassemblage en dessous de la concentration critique

18 Nucléation des microtubules Vitesse de formation de nouveaux microtubules : Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP Exposant de nucléation : environ 6,2

19 Elongation des microtubules Vitesse délongation indépendante de : - concentration instantanée de tubuline-GTP - concentration initiale en tubuline-GTP Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ? Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?

20 Désassemblage des microtubules Désassemblage par catastrophes Indépendant de la longueur Des facteurs de catastrophes des oligomères ?

21 Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules Des oligomères de tubuline ? Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules Fermeture de feuillets Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe Des oligomères facteurs de catastrophes ?

22 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

23 Recherche doligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules Production dassemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent Protocole dérivé de méthodes de production « damorces » de microtubules : pontage modéré Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l EGS Collecte des fragments de microtubules stabilisés Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm

24 Caractérisation des solutions doligomères de tubuline Les solutions doligomères stimulent lassemblage des microtubules sous la concentration critique Absence de fragments de microtubules dans les solutions - filtration 100 nm - observation en immunofluorescence

25 Caractérisation des solutions doligomères Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm) Des oligomères linéaires Microscopie électronique Diffusion de lumière

26 Structure des oligomères Liaison de GTP par le dimère de tubuline Liaison de GTP par le dimère de tubuline échangeable sur la sous-unité Structures possibles des oligomères Structures possibles des oligomères Association longitudinale Association latérale Feuillet

27 Propriétés de liaison du GTP par les oligomères Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif Des oligomères formés par association latérale de dimères Affinité plus faible Echange plus lent contraintes liées au pontage ?

28 Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères Tubuline assemblée Longueur moyenne des microtubules Concentration en microtubules Exposant de nucléation

29 Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule

30 Caractérisation dun intermédiaire de nucléation Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères 42 nm environ 10 dimères Taille + diffusion dynamique de la lumière 65% de tubuline sous forme oligomérique Exposant de nucléation : environ 4 4 oligomères se combinent pour former un microtubule formation dun feuillet ? Les microtubules ne désassemblent pas spontanément * Absence de facteurs de catastrophes ?

31 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

32 Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline

33 Partenaires de la tubuline éUn nombre limité de partenaires éDes partenaires variables selon la nature des extraits

34 Protéines identifiées é MAPs et moteurs é MAPs et moteursMAP2, KIF21A é Protéines de la famille EB é Protéines de la famille EBEB1, EB2 é HSPs é HSPsHSP70, HSP90 é Enzymes du métabolisme é Enzymes du métabolismeCitrate lyase

35 Efficacité de la méthode Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire é Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire Identification toujours en cours Utilisation dextraits cellulaires humains (séquençage achevé) Grande diversité dextraits cellulaires possibles é Purification de partenaires interférant avec l assemblage Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans lassemblage Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne é Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne Identification deffecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes

36 Plan ê Introduction : le cytosquelette microtubulaire ê Objectifs ê Facteurs contrôlant la cinétique dassemblage des microtubules ê Caractérisation doligomères stimulant la nucléation des microtubules ê Recherche de nouveaux effecteurs de lassemblage des microtubules ê Conclusions et perspectives

37 Conclusions é Facteurs contrôlant lassemblage des microtubules Nucléation en deux étapes (oligomères ?) Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes Facteurs de catastrophes = oligomères? é Stabilisation et caractérisation doligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré Oligomères formés par association latérale denviron 10 dimères Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule é Identification de partenaires de la tubuline Des partenaires identifiés « qui font sens » Identifications en cours

38 Perspectives Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette ê Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette Mesure de lactivité sur la nucléation, lélongation, le désassemblage Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères Recherche de facteurs de catastrophes Réalisation dun « protéome » des partenaires de la tubuline êTransposition aux études cellulaires Effet des oligomères de nucléation dans les cellules


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