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Synthèse de nouvelles quinones hétérocycliques et évaluation biologique in vitro sur Toxoplasma gondii Thèse de Doctorat d’université Muriel CUDEL COMPAIN-BATISSOU.

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1 Synthèse de nouvelles quinones hétérocycliques et évaluation biologique in vitro sur Toxoplasma gondii Thèse de Doctorat d’université Muriel CUDEL COMPAIN-BATISSOU 20 décembre 2007

2 Objectifs Synthèse de nouvelles quinones hétérocycliques
Par application des cycloadditions de Diels-Alder 1,3-dipolaire Evaluation biologique in vitro sur T. gondii

3 1ère partie: synthèse chimique

4 Le contexte Notre travail s’est inscrit dans le cadre d’un travail en collaboration entre les équipes de l’EA 3741 ‘écosystème et molécules bioactives’ Ce travail s’est basé sur les travaux du laboratoire de chimie organique et du laboratoire de parasitologie avec la synthèse de dérivés p-carbazolequinones par réaction de Diels-Alder et les tests d’inhibition d’une enzyme clé du métabolisme des purines, la purine nucléoside phosphorylase de T. gondii.

5 Les p-carbazolequinones naturelles ont été isolées à partir de différentes plantes ou bactéries.
Nombreuses propriétés biologiques intéressantes

6 Parmi les molécules synthétisées par notre laboratoire, de nombreuses molécules ont déjà été testées sur la purine nucléoside phosphorylase.

7 Nouvelles quinones : synthèse et évaluation

8 Les ortho-carbazolequinones
En comparaison, les o-carbazolequinones ont été moins étudiées que les p-carbazolequinones . Études de la réactivité de ces quinones particulières vis-à-vis de diènes: Carbodiènes Azadiènes Synthèse de ces nouvelles quinones hétérocycliques par la réaction de Diels-Alder

9 Les ortho-carbazolequinones
Les ortho-carbazolequinones naturelles ont été isolées à partir de Streptomyces. Propriétés biologiques: inhibition de L-glutamate, propriétés antioxydantes, inhibition de la peroxydation lipidique

10 Synthèse des o-carbazolequinones
L’équipe de Knölker : Création des liaisons C-C et C-N « one pot » : réaction du sel de fer tricarbonyle complexé sur une diméthoxyaniline. Démétallation par l’oxyde de triméthylamine, suivie d’une déshydrogénation catalytique. L’acide de Lewis tribromure de bore clive les éthers de méthyle en alcool, qui sont oxydés à l’air.

11 Synthèse des o-carbazolequinones
L’équipe de Knölker : Addition de l’amine en C-5 de la benzoquinone. Etape-clé: cyclisation catalysée d’une anilinoquinone par l’acétate de palladium (II). Le palladium II est réduit en palladium (0), puis réoxydé in situ par l’acétate cuivrique. Addition nucléophile sur la carbazolequinone: obtention de la carbazolequinol. Déprotection et déshydratation en milieu acide. anilinoquinone Déprtection plus déhydratation

12 Synthèse des o-carbazolequinones
L’équipe de Choshi : L’addition du magnésien (bromure d’éthynylmagnésium) sur l’indole carboxaldéhyde, suivi du traitement par le chlorométhyl méthyl éther (groupement protecteur de la fonction alcool) conduit au composé 29. Le traitement par le tert-butanolate en présence de tert-butanol de potassium permet la cyclisation (benzo annelation). Les groupements protecteurs de l’azote et de l’alcool sont enlevés. L‘oxydation par l’anhydride benzenesélénique conduit à la carbazolequinone.

13 Synthèse des o-carbazolequinones
L’équipe de Pindur : L’étape clé : cyclisation entre 2-vinylindole et le chlorure d’oxalyle en présence d’acide de Lewis.

14 Synthèse des o-carbazolequinones
L’équipe de Rawat : La cyclisation est réalisée photochimiquement. Les groupements protecteurs de l’azote et des alcools sont enlevés.

15 Synthèse des benzocarbazole-5,6-diones
Obtenir le précurseur Cyclisation

16 Synthèse des benzocarbazole-5,6-diones
L’équipe d’Echavarren Hydroxylation en 3 Déprotection et cyclisation au reflux du méthanol Dérivés ortho et para en proportion égale

17 Synthèse des benzocarbazole-5,6-diones
Toujours pas de synthèse permettant d’obtenir des benzocarbazolequinone sans dérivé para associé Équilibre tautomère Dans cette partie bibliographique, on a cherché également les travaux concernant les CA diels Alder des o carbazolequinones L’équipe de Kobayashi Réduction du groupement nitro par hydrogénation catalytique Cyclisation au reflux de l’acétate d’éthyle Proportion des dérivés ortho et para : variable selon le substituant R1 = R2 = OMe : proportion égale R1 = R2 = Me, 54 majoritaire

18 Réaction de Diels-Alder sur les o-quinones
Aucune réaction décrite pour les o-carbazolequinones Réactions décrites pour les o-indoloquinones qui sont de structures voisines Nous an

19 Travaux personnels Objectifs Stratégie
Réaction de Diels-Alder sur les o-carbazolequinones: Carbodiènes Azadiènes Stratégie Obtenir des hydroxycarbazoles Oxydation de ces hydroxycarbazoles par le sel de Frémy Réactions de Diels-Alder

20 Travaux personnels Les hydroxyquinones Deux 2-hydroxycarbazoles:
2-hydroxycarbazole: commercial 2-hydroxy-9-méthyl-(9H)-carbazole Un 3 hydroxycarbazole obtenu à partir du 3-aminocarbazole commercial Méthylation sélective par la méthode d’Albanese : N-alkylation sélective sans O-protection : excès de base forte, conditions rigoureusement anhydres Solvant aprotique polaire: THF Solvant un peu plus polaire : DMF: solvate les cations, rend plus réactif les paires d’ions Diazotation suivie d’une hydrolyse

21 Travaux personnels Obtention du 3 hydroxycarbazole : autre méthode
Décrite par l’équipe de Cohen: Formation d’un sel de diazonium Formation d’un radical aryl à l’aide d’ion cuivre : Cu2O et large excès de Cu(NO3)2 Oxydation en phénol à température ambiante Pas d’amélioration du rendement Si la quantité de sel de diazonium augmente, diminution du rendement

22 Travaux personnels Oxydation des hydroxycarbazoles par le sel de Frémy
Les deux quinones 81a et 81b ne posent pas de problème de solubilité.

23 Travaux personnels Oxydation de l’aminocarbazole par le sel de Frémy
Faible rendement pour obtenir la carbazole-3,4-dione L’oxydation des anilines disubstituées par le sel de Frémy conduit aux p-benzoquinones avec de bon rendement Mais obtention des dérivés 92 et 93

24 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’acétoxybutadiène Les cycloadduits primaires n’ont pas été observés

25 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec le cyclopentadiène

26 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec le cyclopentadiène Confirmation de la stéréochimie par RMN-1H NOE différentielle l’irradiation du signal de H-4a à 3,42 ppm au niveau de H-11c à 4,12 ppm (10,8%) au niveau des H-12 à 1,71 ppm (3,1%) l’irradiation du signal de H-11c à 4,12 ppm H-4a à 3,42 ppm (11,8%) H-1 et H-4 à 3,59 ppm (4,1%) H-12 à 1,71 ppm (3,8%) H-11 à 7,87 ppm (3%) l’irradiation du signal de H-12 à 1,71 ppm   H-1 et H-4 à 3,6 ppm (11%) H-11c à 4,12 ppm (6,7%) H-4a à 3,41 ppm (3,6%).

27 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec le cyclopentadiène Confirmation de la stéréochimie par RMN-1H NOE différentielle

28 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’azadiène 96
Carbazole-3,4-diones : mélange de produits: échec Un seul produit isolé, l’aminoquinone 99

29 Travaux personnels Réaction de cycloaddition [4+2] avec l’azadiène 96
Carbazole-1,2-diones : mélange de produits: échec Solvant Température Temps Conditions EtOH absolu Reflux 1 nuit Al2O3 basique Al2O3 basique N2 6 H N2/ ultra-sons t.a 48 H Silice THF anhydre Toluène

30 Conclusion Nous avons montré que les réactions de Diels-Alder sont possibles avec les o-carbazolequinones et les carbodiènes. Avec les azadiènes, nous n’avons pas pu réaliser de cycloaddition, alors que nous avions pu obtenir les pyridocarbazole-5,11-diones à partir des p-carbazolequinones La réactivité de ces o-carbazolequinones est moins importante que celle des p-carbazolequinones. Les rendements pour obtenir ces o-carbazolequinones sont faibles.

31 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition de p-quinones avec le dipôle oxyde de nitrile L’équipe de Shiraishi : p-benzoquinones polysubstituées l’oxyde de 2,4,6-triméthylbenzonitrile l’oxyde de 2,6-dichlorobenzonitrile Soit addition sur la C=C : dérivés isoxazoloquinones Soit addition sur la C=O : dérivés spiranniques les p-quinones divisées en deux groupes un groupe qui donne des additions sur C=O et pour lequel la réaction est gouvernée par l’interaction entre la HOMO de l’oxyde de nitrile et la LUMO de la quinone. l’autre groupe donne des additions sur C=C et pour lequel la réaction est gouvernée par l’interaction entre la LUMO de l’oxyde de nitrile et la HOMO de la quinone

32 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition de p-quinones avec le dipôle oxyde de nitrile L’équipe de Shiraishi : p-benzoquinones polysubstituées l’oxyde de 2,4,6-triméthylbenzonitrile l’oxyde de 2,6-dichlorobenzonitrile Soit addition sur la C=C : dérivés isoxazoloquinones Soit addition sur la C=O : dérivés spiranniques

33 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition des naphtoquinones avec les oxydes de nitrile L’équipe de Brahmeshwari Addition exclusive sur la C=C Obtention des cycloadduits primaires : naphtoisoxazolinequinones Aromatisation lors de la purification sur une colonne de gel de silice Avec l’oxyde de nitrile 150, pas de cycloadduit primaire observé

34 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition des naphtoquinones dissymétriques avec les oxydes de nitrile : obtention de deux régioisomères Addition exclusive sur la C=C Obtention des cycloadduits primaires : naphtoisoxazolinequinones Avec l’oxyde de nitrile 150, pas de cycloadduit primaire observé Action régiosélective, proportion variable

35 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition des naphtoquinones dissymétriques avec les oxydes de nitrile L’équipe de Behar a réalisé une cycloaddition 1,3-dipolaire régio-orientée Utilisation d’une quinone bromée Formation d’un seul régioisomère

36 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition des p-napthoquinones avec les azotures L’équipe d’Alonso Synthèse de naphtotriazole diones En fonction du solvant et de la température utilisée: Formation de naphtotriazole diones, d’aminoquinones, aminométhylène-indanediones

37 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Réaction de cycloaddition des p-quinones avec les azotures L’équipe de Beneti a étudié l’effet du solvant et de la température sur la réaction de cycloaddition des azotures de p-méthoxyphényle. L’élévation de température favorise la formation des composés ènamine, benzapine et aziridine aux dépends du triazole A température égale, l’HMPT favorise la formation du triazole

38 Cycloadditions 1,3-dipolaires
Concernant les cycloadditions avec les oxydes de nitrile: Formation à partir d’oxime Cycloaddition sur C=C ou C=O selon la nature de l’oxyde de nitrile et la quinone Sur les p-quinones dissymétriques: problème de régiosélectivité, possibilité d’orienter la régiosélectivité avec les p-quinones bromées Concernant les cycloadditions avec les azotures Formation de triazoline et selon les conditions de température et solvant: Obtention du triazole, ou bien formation d’ènamine, d’aminoquinone, d’aziridine, de benzopyrine Les températures élevées nuisent à la formation du triazole Les solvants type HMPT favorisent la formation de triazole La polarité du solvant ne semble pas influencer la formation de triazole, ou d’ènamine,…

39 Travaux personnels Objectifs Stratégie
Réaction de cycloaddition 1,3-dipolaire sur les p-carbazolequinones: Oxydes de nitrile Azotures Etude de la régiochimie de ces réactions Stratégie Obtenir l’hydroxycarbazole Oxydation de cet hydroxycarbazole par le sel de Frémy Réactions de cycloaddition 1,3-dipolaire

40 Travaux personnels Obtention du 4-hydroxycarbazole : deux méthodes
formation de phénylhydrazinocyclohéxènone, puis synthèse indolique de Fisher conduisant à la tétrahydrocarbazolone. L’étape d’éthylation est réalisée afin d’obtenir des composés plus solubles que les dérivés non substitués sur l’azote. Enfin, déshydrogénation à l’aide du Palladium sur charbon au reflux du diphényléther (259°C)

41 Travaux personnels Obtention du 4-hydroxycarbazole : deux méthodes
Commercialisation du 4-hydroxycarbazole 200 L’étape d’éthylation est réalisée afin d’obtenir des composés plus solubles que les dérivés non substitués sur l’azote. N-éthylation directe sans protection de la fonction alcool selon la méthode décrite plus haut mise au point par l’équipe d’Albanese.

42 Travaux personnels Oxydation par le sel de Frémy

43 Travaux personnels Synthèse des oxydes de nitriles : deux méthodes
À partir d’aldoxime, réaction d’halogénation, suivie déshydrohalogénation en milieu basique Méthode 2: Déshydrogénation de l’aldoxime par l’hypochlorite ou l’hypobromite de sodium

44 Travaux personnels Synthèse des oxydes de nitriles Cycloaddition
Par déshydrogénation au moyen d’hypochlorite de sodium dans le THF à 0°C Cycloaddition Obtention des deux régioisomères, en proportion égale Observation des cycloadduits primaires, qui finissent par disparaître

45 Travaux personnels Afin d’obtenir une régioselectivité de la réaction de cycloaddition: synthèse de 2 et 3-bromocarbazolequinones Synthèse de la 2-bromocarbazolequinone H-2 est plus acide que H-3 car C-1 est moins riche en électron que C-4 H-2 s’élimine plus facilement Déshydrobromation conduisant à la 2-bromocarbazolequinone L’acide acétique doit être rigoureusement anhydride

46 Travaux personnels Synthèse de la 3-bromocarbazolequinone
Bromation à l’aide du N-bromosuccinimide Obtention de deux hydroxycarbazoles monobromé et dibromé (proportion 9:1) Oxydation par le sel de Frémy conduit à une seule bromocarbazolequinone

47 Travaux personnels Cycloaddition avec les bromocarbazolequinones
Aucun adduit primaire observé Réaction totalement régiosélective

48 Travaux personnels Détermination structurale par RMN 1H NOE
Dans le cas de l’isomère 213, l’irradiation à 8,12 ppm (H-3’) : réponses au niveau de H-4’ à 7,81 ppm H-5 à 8,36 ppm. l’irradiation du signal du CH3 du groupe éthyle à 1,52 ppm donne des réponses au niveau du CH2 du groupe éthyle à 4,53 ppm du H-8 à 7,48 ppm. Dans le cas de l’isomère 214, l’irradiation du signal du CH3 du groupe éthyle à 1,47 ppm donne quatre réponses : à 7,88 ppm (H-3’), à 7,47 ppm (H-6), à 4,70 ppm (CH2 du groupe éthyle) à 2,71 ppm (CH3-6’). L’irradiation du signal de H-3’ à 7,88 ppm donne, une réponse au niveau de H-4’, une réponse au niveau du CH3 du groupe éthyle à 1,47 ppm.

49 Travaux personnels Détermination structurale par RMN 1H NOE

50 Travaux personnels Pour les composés 211 et 212 : comparaison des spectres IR avec les régioisomères 213 et 214: 211 et 213 présentent 2 bandes d’absorption à 1673 et 1658 cm-1 : bandes C=O 212 et 214 présentent 1 seule bande d’absorption à 1673 cm-1 pour 212 et à 1667 pour 214: bande C=O

51 Travaux personnels Théorie des orbitales frontières : étudier réactivité du dipôle et du dipolarophile par calcul des énergies de orbitales frontières HOMO et LUMO et rendre compte de la régiosélectivité des cycloadditions en utilisant les coefficients Dipolarophile substitué par un groupe électroattracteur : réaction entre la HOMO du dipôle et la LUMO du dipolarophile. dipolarophile substitué par un groupe électrodonneur : réaction entre la HOMO du dipolarophile et la LUMO du dipôle. Les carbazolequinones 201, 203 et 206 : dipolarophiles appauvris en électrons par l’effet mésomère attracteur des deux carbonyles en C-1 et C-4, l’interaction entre les orbitales HOMO du dipôle et LUMO du dipolarophile Pour les quinones bromées, la différence d’énergie est faible qu’avec la quinone non bromée: en pratique, pas de différence de réactivité

52 Travaux personnels Théorie des orbitales frontières : étudier réactivité du dipôle et du dipolarophile par calcul des énergies de orbitales frontières HOMO et LUMO et rendre compte de la régiosélectivité des cycloadditions en utilisant les coefficients

53 Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition : calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des oxydes de nitrile 209 et 210 au niveau des atomes d’oxygène et de carbone. Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3. Pour les oxydes de nitriles 209 et 210, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’oxygène. En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les oxydes de nitrile 209 et 210 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 212 et 214.

54 Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition : calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des oxydes de nitrile 209 et 210 au niveau des atomes d’oxygène et de carbone. Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3. La présence d’un atome de brome en C-2 ou en C-3 entraîne une augmentation de ces coefficients mais celui de C-3 reste toujours le plus élevé. Pour les oxydes de nitriles 209 et 210, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’oxygène. En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les oxydes de nitrile 209 et 210 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 212 et 214. Or, les résultats expérimentaux montrent que Pour la quinone non bromée : obtention des deux régioisomères dans des proportions identiques Pour la quinone bromée en 2 : obtention des régioisomères 211 et 213 Pour la quinone bromée en 3 : obtention des régioisomères 212 et 214

55 Conclusion Deux hypothèses :
En tenant compte des coefficients orbitalaires, on devrait obtenir majoritairement 212 et 214. En considérant que l’orientation de la cycloaddition est sous le contrôle de l’atome de brome conformément à ce qui a été décrit dans la littérature (l’oxygène de l’oxyde de nitrile attaque le carbone bromé de la quinone), on devrait obtenir majoritairement ou exclusivement les régioisomères 211 et 213 à partir de la 2-bromoquinone 203 et les régioisomères 212 et 214 à partir de la 3-bromoquinone 206. Nos résultats confirment clairement cette deuxième hypothèse. En effet, La sélectivité est gouvernée par la position de l’atome de brome, avec une attaque préférentielle de l’oxygène de l’oxyde de nitrile sur le carbone bromé de la quinone. Nous avons obtenu d’une manière totalement régiosélective chaque régioisomère.

56 Travaux personnels Synthèse des azotures : méthode décrite par Buckle
Synthèse des azotures de benzyle 217 et de 4-méthoxybenzyle 172 : par substitution nucléophile sur les halogénures correspondants 215 et 216, au moyen de l’azoture de sodium, La réaction est réalisée à l’abri de la lumière, dans l’éthanol pendant 24 h. La solution est ensuite reprise dans l’éther éthylique, lavée à l’eau pour éliminer l’azoture de sodium en excès, séchée et évaporée sous vide à une température inférieure à +20°C. Les azotures sont alors isolés sous forme d’une huile claire et utilisés sans purification

57 Travaux personnels Cycloaddition : obtention des deux régioisomères, en proportion 4/1 ou 3/1 Différents solvants testés: comme le toluène, l’acétate d’éthyle ou le THF, éthanol, à température amb. Pour l’azoture 217 : après 2 semaines de réaction, obtention d’un précipité orange qui est filtré : il contient les deux régioisomères 218 et 219, séparation par chromatographie sur colonne de gel de silice. Proportions 218/219 = 4/1. Pour l’azoture 172 : après 2 semaines de réaction, le solvant est évaporé à sec et le produit brut est repris dans l’éther éthylique pour donner un précipité orange constitué par les deux régioisomères 220 et 221, séparation par chromatographie sur colonne de gel de silice. Proportions 220/221 = 3/1.

58 Travaux personnels Cycloaddition avec la 2-bromoquinone : obtention d’un seul régioisomère La cycloaddition de la 2-bromocarbazolequinone 203 et de l’azoture de benzyle 217 ou 172 a été réalisée dans l’acétonitrile à température ambiante pendant 3 à 4 jours. Obtention d’un précipité orange qui apparaît dans le milieu, constitué du seul régioisomère 218 ou est recristallisation dans l’éthanol, tandis que 220 est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice. La cycloaddition de la 2-bromocarbazolequinone 203 avec les azotures 172 et 217 est totalement régiosélective. Dans le cas des azotures, la sélectivité est en faveur de l’isomère dans lequel l’atome N-1 de l’azoture est lié au carbone-3 (non bromé) de la quinone.

59 Travaux personnels Cycloaddition avec la 3-bromoquinone : obtention des deux régioisomères La cycloaddition est effectuée dans l’éthanol à température ambiante, et elle conduit au mélange des deux régioisomères. La régiosélectivité, dans ce cas, est en faveur des isomères 219 et 221, dans lesquels l’atome N-1 de l’azoture est lié au carbone-2 (non bromé) de la quinone. Les proportions des régioisomères avoisinent, dans les deux réactions, le rapport 1/2, alors que les proportions des régioisomères avec la quinone non bromée avoisine le rapport 4/1 ou 3/1.

60 Travaux personnels Détermination structurale
Confirmation de la régiochimie par étude des corrélations 1H-13C HMBC, réalisée sur le couple de régioisomères 220 / 221 Méthylation sélective par la méthode d’Albanese : N-alkylation sélective sans O-protection : excès de base forte, conditions rigoureusement anhydres Solvant aprotique polaire: THF Solvant un peu plus polaire : DMF: solvate les cations, rend plus réactif les paires d’ions Diazotation suivie d’une hydrolyse Pour l’isomère 220, présence d’un couplage J4 : entre les protons CH2 du groupement éthyle (4,76 ppm) et C-4 (172,86 ppm) entre les protons CH2 du groupement p-méthoxybenzyle (5,93 ppm) et C-10 (172,74 ppm). Pour l’isomère 221, présence d’un couplage J4: entre les protons CH2 de l’éthyle (4,69 ppm) et C-4 (170,26 ppm), entre CH2 du groupement p-méthoxybenzyle (5,88 ppm) et C-4 (170,26 ppm), C-10 (175,24 ppm) n’est pas corrélé.

61 Travaux personnels Détermination structurale
Pour les isomères 218 et 219 : comparaison de leurs spectres RMN 13C et IR respectivement avec ceux des régioisomères 220 et 221 : analogie Concernant RMN 13C : analogie concernant les déplacements chimiques des carbones carbonyliques C-4 et C-10 : 218 et 220 : à partir 2-bromoquinone, 219 et 221 à partir 3-bromoquinone. Concernant les spectres IR: 218 et 220 présentent deux bandes d’absorption relatives aux deux carbonyles : 1678 et 1652 cm-1 pour 218 et 1679 et 1655 cm-1 pour 220 219 et 221, ils ne présentent qu’une seule bande C=O à 1667 cm-1 pour le premier et à 1670 cm-1 pour le second d C-4 (ppm) d C-10 (ppm) 218 172,90 172,68 220 172,86 172,74 219 170,42 175,44 221 170,26 175,24 Méthylation sélective par la méthode d’Albanese : N-alkylation sélective sans O-protection : excès de base forte, conditions rigoureusement anhydres Solvant aprotique polaire: THF Solvant un peu plus polaire : DMF: solvate les cations, rend plus réactif les paires d’ions Diazotation suivie d’une hydrolyse

62 Travaux personnels Théorie des orbitales frontières :
Les carbazolequinones 201, 203 et 206 : dipolarophiles appauvris en électrons => la réaction de cycloaddition dipolaire-1,3 avec les azotures devrait se faire par l’interaction entre les orbitales HOMO du dipôle et LUMO du dipolarophile. La différence d’énergie entre HOMO azoture / LUMO quinone est plus faible que celle entre HOMO quinone / LUMO azoture Pour les quinones bromées, la différence d’énergie est faible qu’avec la quinone non bromée: en pratique, pas de différence de réactivité

63 Travaux personnels Théorie des orbitales frontières :

64 Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition : calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des azotures 217 et 172 au niveau des atomes d’azote N-1 et N-3. Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3. Pour azotures 217 et 172, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’azote N-1. En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les azotures 217 et 172 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 218 et 220.

65 Travaux personnels Afin d’étudier la régiosélectivité de la réaction de cycloaddition : calcul, par la même méthode, des coefficients des orbitales LUMO des quinones 201, 203 et 206 au niveau des carbones C2 et C3 des orbitales HOMO des azotures 217 et 172 au niveau des atomes d’azote N-1 et N-3. Pour les trois quinones 201, 203 et 206 le coefficient le plus élevé se trouve en C-3. La présence d’un atome de brome en C-2 ou en C-3 entraîne une augmentation de ces coefficients mais celui de C-3 reste toujours le plus élevé. Pour azotures 217 et 172, le coefficient le plus élevé apparaît sur l’atome d’azote N-1. En se basant sur le principe du recouvrement maximum des orbitales frontières, les réactions de cycloaddition dipolaire [3+2] entre 201 et les azotures 217 et 172 devraient conduirent préférentiellement aux régioisomères respectifs 218 et 220. Or, les résultats expérimentaux montrent que Pour la quinone non bromée : obtention des deux régioisomères avec 218 et 220 majoritaire. Pour la quinone bromée en 2 : obtention des régioisomères 218 et 220 Pour la quinone bromée en 3 : obtention des régioisomères 219 et 221 majoritaires (218 et 220 minoritaires)

66 Conclusion Deux hypothèses :
En tenant compte des coefficients orbitalaires, on devrait obtenir majoritairement 218 et 220. En considérant que l’orientation de la cycloaddition est sous le contrôle de l’atome de brome (comme pour les cycloadditions avec les oxydes de nitrile), on devrait obtenir majoritairement ou exclusivement les régioisomères 218 et 220 à partir de la 2-bromoquinone 203 et les régioisomères 219 et 221 à partir de la 3-bromoquinone 206. Nos résultats confirment clairement cette deuxième hypothèse. En effet, La sélectivité est gouvernée par la position de l’atome de brome, avec une attaque préférentielle de l’azote N-1sur le carbone non bromé de la quinone. Nous avons obtenu d’une manière totalement régiosélective les régioisomères 218 et 220, alors que la quinone bromée en C-3 nous a permis d’obtenir majoritairement les régioisomères 219 et 221 .

67 Conclusion Nous avons obtenu
par réaction de cycloaddition de Diels-Alder sur les o-carbazolequinones, quatre produits de cycloaddition. par cycloaddition 1,3-dipolaire : quatre dérivés isoxazolecarbazolequinones, quatre dérivés triazolecarbazolequinones des quinones tricycliques : trois o-carbazolequinones, trois p-carbazolequinones dont deux bromées. trois hydroxycarbazoles deux dérivés dimères de type carbazole-carbazolequinone Nous avons montré que la cycloaddition de Diels-Alder sur les o-carbazolequinones est possible avec les carbodiènes Nous avons trouvé une méthode efficace pour obtenir des cycloadditions 1,3-dipolaires régiosélectives sur des p-carbazolequinones

68 2ème partie : évaluation biologique in vitro sur Toxoplasma gondii

69 Toxoplasma gondii Protozoaire parasite de l’embranchement des Apicomplexa, ubiquitaire, responsable d’atteinte fœtale en cas d’infection chez la femme enceinte non immunisée, et d’atteintes cérébrale et oculaire principalement par réactivation des kystes chez les sujets immunodéprimés. Développement intracellulaire obligatoire

70 Toxoplasma gondii Cycle cellulaire :
un hôte définitif : félidés : reproduction asexuée et sexuée Sporulation en milieu extérieur Hôtes intermédiaires : animaux homéothermes: reproduction asexuée, enkystement dans le tissu cérébral, oculaire, musculaire.

71 La toxoplasmose Asymptomatique dans 80% des cas chez le sujet immunocompétent Si symptomatique: atteinte ganglionnaire, oculaire Forme sévère: atteintes cutanées ou multiviscérales (hépatique, myocardique,..) Chez l’immunodéprimé : Atteinte cérébrale par réactivation des kystes: encéphalite toxoplasmique : fièvre et une symptomatologie neurologique très diverse : céphalées, déficits moteurs ou sensitifs, comitialité, troubles psychiatriques. Localisation oculaire: associé à une atteinte cérébrale dans 10 à 20% des cas. Localisation pulmonaire: pneumopathie hypoxémiante, très souvent fatale.

72 La toxoplasmose Chez la femme enceinte non immunisée : atteinte foetale Polymorphisme clinique : symptomatologie variable en fonction de l’âge du fœtus au moment de l’infection. Au cours du 1er trimestre de grossesse, l’infection fœtale se produit dans moins de 6 % des cas mais conduit dans la majorité des cas à une forme sévère ou à une perte fœtale. A l’inverse, au 3ème trimestre de grossesse, le passage trans-placentaire survient dans 80 % des cas et donne généralement une infection infra-clinique. Au cours du second semestre, l’infection fœtale se produirait dans 25 à 30 % des cas. Tableau clinique Atteinte neurologique avec hydrocéphalie (obstruction de l’aqueduc de Sylvius), microcéphalie, microphtalmie avec ou sans rétinochoroïdite. Ces signes peuvent être observés à la naissance ou être diagnostiqués plus tard. Atteinte généralisée sévère avec exanthème maculo-papulaire, purpura, pneumonie, ictère, hépato-splénomégalie. Ce tableau peut se présenter avec ou sans atteinte oculaire ou neurologique. Atteinte modérée avec hépato-splénomégalie et ictère, avec ou sans thrombocytopénie. Atteinte infra-clinique : le patient peut rester asymptomatique tout au long de sa vie ou au contraire présenter des atteintes oculaires dont la gravité dépend de la localisation par rapport à la macula.

73 La toxoplasmose: schémas thérapeutiques
Chez l’immunocompétent : abstention Si forme sévère : pyriméthamine + sulfadiazine Si forme bénigne: spiramycine ou cotrimoxazole Prévention de la transmission materno-foetale : Si infection fœtale non prouvée: traitement de la mère par spiramycine Si infection fœtale prouvée: pyriméthamine + sulfadiazine ou pyriméthamine + sulfadoxine (+ folinate de calcium) Toxoplasmose congénitale pyriméthamine+sulfadiazine ou sulfadoxine pendant au moins douze mois (+ acide folinique). Le traitement des rechutes et en particulier des rétinochoroïdites toxoplasmiques aiguës associe préférentiellement pyriméthamine + sulfamide, éventuellement associés à une corticothérapie lorsque la composante inflammatoire est importante

74 La toxoplasmose: schémas thérapeutiques
Traitement curatif de l’immunodéprimé association pyriméthamine + sulfadiazine ou pyriméthamine + clindamycine en administrant systématiquement de l'acide folinique. Un traitement par dose de charge pendant 48 heures est suivi par un traitement à pleine dose pendant 4 à 6 semaines. Atteinte neurologique avec hydrocéphalie (obstruction de l’aqueduc de Sylvius), microcéphalie, microphtalmie avec ou sans rétinochoroïdite. Ces signes peuvent être observés à la naissance ou être diagnostiqués plus tard. Alternative: cotrimoxazole par voie intraveineuse et à forte dose , pyriméthamine + macrolide, ou atovaquone Traitement prophylactique secondaire Patient VIH+ avec CD4 < 100/mm3 : cotrimoxazole Patient avec greffe moelle allogénique: cotrimoxazole ou sulfadoxine + pyriméthamine Patient transplanté : pyriméthamine seule, cotrimoxazole, sulfadoxine + pyriméthamine

75 Les médicaments Les macrolides et apparentés
Spiramycine Clarithromycine, azithromycine, roxithromycine Clindamycine Inhibiteur de la déshydrofolate réductase Pyriméthamine Trimétoprime (un des composants du cotrimoxazole) Sulfamides Atavoquone : hydroxynaphtoquinone

76 Autres molécules actives in vitro et/ou in vivo
Autres antibiotiques Doxycyline Fluoroquinolones Rifapentine Synercid Autres inhibiteurs de la déshydrofolate réductase Piritrexime, épiroprime Trimetrexate (analogue du méthotréxate) di-amino-quinazolines, di-amino-pteridines , di-amino-tetrahydropyrimido-isoquinoline, de di-amino-dihydrotriazines Analogues de sulfamides Analogues de l’atovaquone Composés trioxanes : artemisinine,… Autres : pentamidine, paclitaxel, ciclosporine A, inhibiteurs de protéases Inhibiteurs du métabolisme des purines Quinones

77 Quinones actives in vitro
Quinones ont été testés à des doses variables de 0,5 à 4 µg/ ml sur une souche virulente RH de T. gondii en 72h.

78 Quinones actives in vitro
L’équipe de Tapia en collaboration avec l’équipe de Fillion Les CI 50 pour l’ensemble des composés 329 à 336 pour T. gondii sont comprises entre 0,0007 et 0,0051 µM. Les CI 50 pour la pyriméthamine et la sulfadiazine sont égales à 0,0034 µM à la fois. Concernant les tests de cytotoxicité, les CI 50 pour l’ensemble des composés 329 à 336 sont comprises entre 0,817 et 0,011 µM. Pour la pyriméthamine la CI 50 est de 0,010 µM et pour la sulfadiazine, la CI 50 est de 0,012 µM Deux quinones 342 et 346 ont montré des activités bien supérieures aux molécules de références avec des toxicités moindres. Les CI 50 sont de 0,0007 µM pour les deux molécules 342 et 346, contre 0,0034 µM pour la sulfadiazine et 0,0034 µM pour la pyriméthamine. naphtothiophenquinones 350 à 353 ont montré une très faible solubilité dans les solvants usuels, ne permettant pas leur évaluation biologique.

79 Travaux personnels Les toxoplasmes sont mis en culture avec des cellules de lignées monocytaires THP1. Culture cellulaire à 37°C, sous atmosphère à 5% de CO2, en milieu humide Milieu contenant du sérum de veau fœtal, de la pénicilline et de la streptomycine Mise en œuvre des tests de cytoxicité But: déterminer si les produits à tester sont toxiques ou non pour les cellules THP1 En cas de toxicité, les tests d’inhibition de la croissance de T. gondii ne peuvent pas être menés à bien. Les produits sont testés à des concentrations de 5, 1, 0,5 et 0,1 µM Au bout de 72h d’incubation, la viabilité est déterminée en utilisant le réactif de Promega : Cell Titer 96 Aqueous Non radioactive Cell proliferation assay : réaction colorimétrique, la viabilité étant proportionnelle à la quantité de formozan (coloré) formé par les enzymes déshydrogénases des cellules métaboliquement actives. Lecture de l’absorbance à 490 nm Analyse statistique

80 Travaux personnels Mise en œuvre des tests de d’inhibition de la croissance Le nombre de cellules est compté en cellule de Malassez et ajusté à 100 000 cellules/ ml pour les THP1 et / ml pour les tachyzoïtes. Les produits sont testés à des concentrations de 0,2 et 0,1 µM Incubation 72h à 37°C sous 5% de CO2 en milieu humide. Le bleu trypan est ajouté aux solutions. Les cellules et tachyzoïtes vivants ne sont pas perméables et ils restent non colorés, tandis les cellules et tachyzoïtes altérés sont colorés en bleu. Les tachyzoïtes vivants sont comptés en cellule de Malassez, et les résultats sont analysés par rapport aux puits de contrôle. Analyse statistique

81 Travaux personnels Produits testés

82 Travaux personnels Résultats CI 50 (µM) THP1 CI 50 (µM) T.gondii 81
0,769 ± 0,042 0,247 ± 0,040 82 0,232 ± 0,018 0,499 ± 0,068 83 0,794 ± 0,064 0,252 ± 0,015 87 1,419 ± 0,086 0,478 ± 0,141 94 0,216 ± 0,019 0,307 ± 0,057 95 1,054 ± 0,055 0,232 ± 0,008 211 0,236 ± 0,012 0,242 ± 0,020 212 0,239 ± 0,014 0,172 ± 0,007 213 0,592 ± 0,025 0,280 ± 0,026 214 0,398 ± 0,034 0,190 ± 0,009 218 0,286 ± 0,021 0,314 ± 0,048 219 0,247 ± 0,014 0,361 ± 0,054 220 0,296 ± 0,044 0,197 ± 0,019 221 0,221 ± 0,014 0,313 ± 0,046 Pyriméthamine 1,213 ± 0,173 0,201 ± 0,014 sulfadiazine 5,821 ± 1,022 0,205 ± 0,018

83 Travaux personnels Produits testés

84 Travaux personnels Résultats
Les molécules o-carbazolequinones tricycliques: peu cytotoxique pour THP1, et toxique sur les toxoplasmes. Les molécules o-carbazolequinones contenant le cyclopentadiène: peu cytotoxique pour THP1, et toxique sur les toxoplasmes. Les molécules o-carbazolequinones tétracycliques: cytotoxique pour THP1 et peu toxique sur les toxoplasmes. Les composés triazolo et isoxazolocarbazolequinones sont cytotoxiques, seul 220 inhibe la croissance de T. gondii comme les références utilisées: sulfadiazine et pyriméthamine. Faible solubilité de ces produits Cytotoxicité liée à la structure plane Nécessité de tester d’autres lignées cellulaires

85 La purine nucléoside phosphorylase
L’inhibition du métabolisme des purines constitue une cible potentielle thérapeutique Les mammifères utilisent deux voies d’accès aux purines : La synthèse de novo à partir de ribose 5-phosphate et de molécules telles que les acides aminés. La voie de sauvetage des purines où l’organisme « recycle » les bases puriques provenant principalement du catabolisme des acides nucléiques, et les transforme en fonction de ses besoins. Les protozaires ne possèdent pas de voie d’accès de novo aux bases puriques. La voie de sauvetage des purines est donc leur seule possibilité afin de disposer des ces bases. Les nucléosides sont importés de leur hôte.

86 La purine nucléoside phosphorylase

87 La purine nucléoside phosphorylase
Détermination de l’activité de plusieurs enzymes de la voie de sauvetage des purines, dans des tachyzoïtes provenant de kystes, par HPLC Six enzymes ont été testés in vivo et in vitro, l’adenosine desaminase, la guanine desaminase, la purine nucléoside phosphorylase, la xanthine oxydase, l’hypoxanthine xanthine guanine phosphoribosyltransférase (HXG PRT) l’adenine phosphoribosyltransferase (A PRT). In vivo, la PNP et l’adénosine désaminase ont montré une activité importante. il existe des différences de structures entre l’enzyme des mammifères et de ce parasite. Cette enzyme est une enzyme clé du métabolisme des purines car elle intervient dans la transformation de l’inosine en hypoxanthine et de la guanine en guanosine. Sélection comme une cible potentielle pour des produits à visée antitoxoplasmique.

88 Parmi les molécules synthétisées par notre laboratoire, de nombreuses molécules ont déjà été testées sur la purine nucléoside phosphorylase.

89 La purine nucléoside phosphorylase
Produits déjà testés Référence : 8-aminoguanosine Ki = 0,2 mM; Ki = 0,07mM

90 La purine nucléoside phosphorylase
Mise en œuvre des tests d’inhibition de la PNP: Obtention d’un échantillon biologique contenant la PNP à partir des toxoplasmes cultivés, après purification. L’activité enzymatique est déterminée par HPLC. La phase mobile est constituée de phosphate d’ammonium NH4H2PO4 à 25mM et de méthanol, la proportion est de 95/5. La PNP contenue dans l’échantillon et les produits testés comme inhibiteurs potentiels sont incubés en présence d’inosine et de phosphate inorganique. Détection à 254 nm de l’hypoxanthine formée, ainsi que l’inosine. Les incubations : 30 min à 37°C dans un bain thermostaté. La molécule de référence choisie est la 8 aminoguanosine, chaque expérience est réalisée en triplicats.

91 La purine nucléoside phosphorylase
Mise en œuvre des tests d’inhibition de la PNP: Problème de purification de la PNP : plus d’un an de « récolte » Problème de solubilité des produits en milieu aqueux : solubilisation dans le DMSO. La concentration choisie correspondant à la concentration maximale pour avoir une solubilité totale, soit une concentration de 0,5µM au final. Résultats Aucune des molécules testées n’est inhibitrice de la PNP, aux concentrations utilisées, alors qu’elles ont des propriétés inhibitrices de la croissance de T. gondii.

92 Conclusion Nous avons synthétisé 23 composés, dont 7 o-carbazolequinones, 4 isoxazolecarbazolequinones, 4 triazolocarbazolequinones, 3 p-carbazolequinones tricycliques, 3 hydroxycarbazoles, 2 biscarbazoles. Nous avons évalué 16 composés Comme inhibiteurs de la croissance de T. gondii Test de cytotoxicité Comme inhibiteurs potentiels de la purine nucléoside phosphorylase Certains de ces composés sont actifs in vitro sur T. gondii, beaucoup de ces composés sont cytotoxiques, ce qui limite leur intérêt comme antiparasitaire Ces produits sont peu solubles en milieu aqueux, ce qui rends l’évaluation biologique difficile Aucun de ces produits synthétisés n’inhibe la PNP. Pour compléter l ’évaluation, il conviendrait de réaliser une évaluation in vivo, pour les produits les moins cytotoxiques. Les molécules pourraient présenter un potentiel comme médicaments cytotoxiques, il serait utile de tester leur effet sur plusieurs lignées cellulaires, afin de déterminer si elles sont sélectives d’une lignée.

93 Merci pour votre attention


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