Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance.

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1 Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128 Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie

2 Hypermutabilité et adaptation bactériennes

3 Survie des bactéries dans l’environnement : transmission fidèle du matériel génétique
≠ Adaptation des bactéries à un environnement fluctuant : modification du matériel génétique Survie/préservation espèce : protéger/transmettre : outils : taux mutation bas Contre balancé par nécessité adaptation : variabilité génétique mini Contradiction? Conciliés : petite prop H=réservoir adaptable Existence d’une petite proportion de bactéries hypermutables au sein des populations

4 Hypermutabilité et évolution
Bactéries mutatrices avec mutations favorables Bactéries non mutatrices avec mutations favorables Chemin indirect (rapide) : Mutateur transitoire Chemin direct (lent) Pression de sélection Bactéries mutatrices Bactéries non mutatrices F. Taddei : modèle relation hypermutabilité / évolution. pop suffisamment grande : petite proportion H. pression (changement de l’environnement) : sélectionne variants adaptés. majorité : non H, acquis mutations favorables, mais probabilité plus faible que les H possibilité retour état non mutateur : évite accumulation mutations délétères (plus probable chez les mutatrices). 2 voies possibles : voie directe et lente (peu probable) voie indirecte et rapide passant par état mutateur. probabilité deuxième voie augmente avec taille et nombre de mutations nécessaires à l’adaptation. définit la notion de mutateur transitoire ; suppose bactéries capables d’adapter vitesse d’évolution selon environnement. Bactéries non mutatrices avec mutations délétères Bactéries mutatrices avec mutations délétères Taddei et al., Science, 1997

5 Deux mécanismes principaux de modification du matériel génétique :
Acquisition de matériel génétique étranger (transfert horizontal puis recombinaison homéologue) Acquisition de mutations et transmission à la descendance (transfert vertical) deux mécanismes principaux matériel génétique étranger acquis par transfert horizontal (conjugaison, transduction ou transformation) puis intégré (recombinaison homéologue – déf) pour transmission mutations ADN transmises transfert vertical. deux mécanismes partiellement contrôlés par le SRM. Partiellement contrôlés par le système de réparation des mésappariements (SRM)

6 Marti, T.M. et al., J. Cell. Physiol., 2002
Le SRM chez E. coli Marti, T.M. et al., J. Cell. Physiol., 2002 surtout étudié chez E. coli ; corrige les erreurs de réplication Description figure Chez H, structures plus touchées : gènes mutS et mutL (bien conservés)

7 Conservation de la protéine MutS
S.aureus ISVKDGGLFKVGFNTQLDEYLEASKNGKTWLAELQAKERQRTGIKSLKISFNKVFGYFIE B.subtilis LSVKEGNLIKDGYNQKLDEYRDASRNGKDWIARLEQQEREYTGIRSLKVGFNKVFGYYIE E.coli VLVRDGGVIASGYNEELDEWRALADGATDYLERLEVRERERTGLDTLKVGFNAVHGYYIQ P.aeruginosa 359 AVIRDGGVIKTGYDAELDELQALSENAGQFLMDLEAREKARTGLPNLKVGYNRIHGYFIE S.aureus ITRANLQNFEPSEFGYMRKQTLSNAERFITDELKEKEDIILGAEDKAIELEYQLFVQLRE B.subtilis VTKANLHLLE--EGRYERNETLTNAERYITPELKEKEALILEAENNICELEYELFTELRE E.coli ISRGQSHLAP---INYMRRQTLKNAERYIIPELKEYEDKVLTSKGKALALEKQLYEELFD P.aeruginosa 419 LPRVQAEQAP---ADYIRRQTLKGAERFITPELKAFEDKALSAQSRALAREKALYEELLE S.aureus EVKKYTERLQQQAKIISELDCLQSFAEIAQKYNYTRPSFSENKTLELVESRHPVVERVMD B.subtilis KVKQYIPRLQQLAKQMSELDALQCFATISENRHYTKPEFSKD-EVEVIEGRHPVVEKVMD E.coli LLLPHLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNYTCPTFIDKPGIRITEGRHPVVEQVLN P.aeruginosa 476 RLIGHLAPLQDSASALAELDVLANLAERALNLDLNRPRFVEHTCLHIEQGRHPVVEQVLE S.aureus YNDYVPNNCRLDNETFIYLITGPNMSGKSTYMRQVAIISIMAQMGAYVPCKEAVLPIFDQ B.subtilis SQEYVPNNCMMGDNRQMLLITGPNMSGKSTYMRQIALISIMAQIGCFVPAKKAVLPIFDQ E.coli EP-FIANPLNLSPQRRMLIITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIGSYVPAQKVEIGPIDR P.aeruginosa 536 TP-FVANDLALDADTRMLVITGPNMGGKSTYMRQTALIVLLAHIGSFVPAARCELSLVDR S.aureus IFTRIGAADDLVSGKSTFMVEMLEAQKALTYATEDSLIIFDEIGRGTSTYDGLALAQAMI B.subtilis IFTRIGAADDLISGQSTFMVEMLEAKNAIVNATKNSLILFDEIGRGTSTYDGMALAQAII E.coli IFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACA P.aeruginosa 595 IFTRIGSSDDLAGGRSTFMVEMSETANILHNATDKSLVLMDEVGRGTSTFDGLSLAWAAA Alignement partie centrale mutS (4espèces) Code couleur Bien conservée

8 Conservation de la protéine MutL
alignement MutL zones bien conservées d’une espèce à l’autre

9 SRM et recombinaison Inhibe la recombinaison entre fragments d’ADN homéologues : barrière à l’échange interspécifique (Matic et al., Trends Microbiol., 1996) Important pour la notion de mutateur transitoire : réacquisition facilitée d’un SRM fonctionnel par recombinaison (de Visser, Microbiology, 2002) Confirmé par la structure en mosaïque des gènes mutS et mutL (Denamur et al., Cell, 2000) rôle SRM pas limité à réparation : recombinaison homéologue formation d’ADN hétéroduplexe : fixation de MutS et MutL et inhibition échange de brins (RecA) et diminution fréquence de recombinaison SRM = barrière à l’échange d’ADN interspécifique. fonction importante : notion de mutateur transitoire. Les mutatrices ayant acquis mutations adaptatives reviennent plus facilement à un état non H confirmé récemment (Denamur) : structure en mosaïque mutS et mutL d’E. coli ( perte puis réacquisition)

10 Hypermutabilité et pathogénicité
Données contradictoires sur cette relation Avantage dans certaines pathologies, dans certaines conditions Ex : forte pression antibiotique environnement hostile et fluctuant Altérations du SRM dans de nombreux cas données contradictoires H pourrait favoriser dans certaines pathologies, sous certaines conditions Ex : mieux supporter des pression antibiotiques élevées, ou adaptation plus facile à un environnement hostile et fluctuant. bactéries pathogènes mutatrices : svt défaut SRM

11 Hypermutabilité et résistance aux antibiotiques
Mutateurs = facteurs de risque : résistance par mutation mutations compensatoires du coût biologique de la résistance Antibiotiques = sélecteurs de l’hypermutabilité (Blazquez, Clin. Infect. Dis, 2003) Sélection de clones résistants Antibiotique A Antibiotique B Sélection de clones résistants Des études plus détaillées mutateurs = facteur de risque : capacité à acquérir à la fois traitements antibiotiques : sélectionnent le phénotype mutateur population classique : clones résistants (fréquence de mutation normale et basse) dose létale A sélectionne clones résistants préexistants : seuls à pouvoir pousser Pop taille suffisante : mutants résistants à B au hasard administration B : sélection nouveaux variants (résistants à A et B) sélection continue si suffisamment de temps pour taille suffisante et acquérir au hasard de nouvelles mutations. Si mutateurs (triangles) : comme premier cas, dose létale A sélectionne clones résistants préexistants (dont mutateur) clones résistants survivent et se multiplient mais proportion de mutateurs augmentée fréquence de mutation élevée plus de chances de produire des variants résistants à B prédominants quand B administré Finalement, quasiment toute la population = mutateurs.

12 Hypermutabilité et mucoviscidose
H dans contexte mucoviscidose.

13 La mucoviscidose Maladie génétique due à une mutation du gène cftr : atteintes pulmonaires et digestives (circulation difficile du chlore à travers la membrane cellulaire) Atteinte pulmonaire : mucus épais contribuant à l’inflammation et à l’infection, principale cause de décès mucoviscidose = maladie génétique, altération cftr, caract par atteintes pulmonaires et digestives (circulation amoindrie chlore membrane) atteinte pulmonaire = épaississement mucus, inflammations sévère, fragilise et facilite les infections. Succession d’infections, principal facteur de décès.

14 Infections bactériennes chez les malades
Espèces bactériennes impliquées : H. influenzae (patients jeunes) S. aureus (patients jeunes) P. aeruginosa (patients plus âgés) Adaptation pour combattre la réponse inflammatoire de l’hôte : P. aeruginosa dits « mucoïdes » small colony variants de S. aureus Administration prolongée de multiples antibiotiques Trois espèces majoritairement impliquées : plus jeunes= H. influenzae et S. aureus, P. aeruginosa = patients plus âgés. stratégies adaptatives particulières face à réponse immunitaire : P aeruginosa mucoïdes, S. aureus “small colony variants” fréquence et sévérité des infections : traitements antibiotiques multiples et prolongés

15 Hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose
P. aeruginosa : 19,5% de souches hypermutables, phénotype surtout dû à des altérations du SRM (Oliver et al., Science, 2000) H. influenzae : 14,5% de souches hypermutables (Roman et al., J. Clin. Microbiol., 2004) étudiée depuis quelques années 2000 Oliver : forte proportion H chez P. aeruginosa muco (svt altération du SRM) cette année : 15% H. influenzae muco de phénotype mutateur proportions deux études plus élevées que la normale (1 à 3%).

16 Les macrolides (transition)

17 Surtout actifs sur les bactéries à Gram positif
Inhibent la synthèse protéique : fixation à la sous unité 50S du ribosome (centre peptidyl transférase) surtout actifs Gram positif inhibent synthèse protéique : fixation sous unité 50S (peptidyl tranférase)

18 Résistance par mutation (1)
NISSEN et al., Science, 2000 L4 L22 décrite chez de nb espèces (in vivo et in vitro) représentation sous unité 50S (cristallographie), PT = centre peptidyl transférase (domaines V et II de l’ARNr 23S), peptide en croissance tunnel de sortie : en partie L4 et L22 macrolides se fixent dans cette région : mutations résistance à = ARNr 23S et L4 et L22.

19 Résistance par mutation (2)
Particulièrement aux positions A2058 et A2059 Mutations de l’ARNr 23S (gène rrl) : faible nombre de copies du gène mycobactéries (1 copie) H. pylori (2 copies) S. pneumoniae (4 copies) Jamais décrites chez S. aureus : 5/6 copies A2058 et A2059 plus fréquemment mutées surtout décrites chez les espèces avec petit nombre de copies Ex : mycobactéries (1), H. pylori (2), S. pneumoniae (4) (au moins 2 copies mutées) jamais décrit chez S. aureus (5 à 6 copies du gène?)

20 Résistance aux macrolides chez S. aureus
Gènes de résistance acquis : S. aureus Macrolide Ribosome (2) ABC transporteur msr(A) Modification enzymatique (3) Jusqu’en 2002 : gènes de résistance acquis 3 types de gènes : erm, méthylase ; msr(A), ABC transporteur ; divers gènes, enzymes de modification Méthylase CH3 (1) erm

21 Résultats (transition)

22 Point de départ de l’étude
Observation au CHU de Caen : augmentation importante de la proportion de S. aureus résistants aux macrolides isolés de mucoviscidose (<30% en 1997, >50% en 1999) Corrélation avec l’augmentation de l’utilisation de l’azithromycine pour son effet indirect putatif sur P. aeruginosa (anti-adhésion et réduisant l’inflammation) ? partie de l’augmentation importante : moins de 30% en 1997 à plus de 50% en 1999 au CHU de Caen A cette époque : premières études rapportant un effet indirect putatif de l’azithromycine sur P. aeruginosa dans la mucoviscidose (antibiotiques généralement inactifs sur Gram négatif : effet du à antiinflammatoire et anti adhésion?). Utilisation cet antibiotique augmentée durant la même période.

23 Analyse des mécanismes de résistance aux macrolides chez les S
Analyse des mécanismes de résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose (transition)

24 Mutations de la cible des macrolides
Patient (Souches) Gènes de résistance ARNr 23S L4 L22 Domaine V Domaine II 1A 1B 1C, 1D - A2058T A2059G A2058G 2B 2C erm 3A 3C 3D 4 16 8 6 4A, 4B msr(A) T2089C, C2207T 5B 5C, 5D, 5E C2163T A2058G, C2207T 7 14 1 6B 6C A2058G + 3 2 9 (4/5) (3/5) (4/6) tableau : résultats obtenus Chaque souche = numéro et lettre 20 souches résistantes / 9 patients 7 gènes de résistance connus ( PCR) portions des domaines V et II de l’ARNr 23S / ensemble protéines L4 et L22 séquencés Rouge : sites connus nombreuses mutations de l’ARNr 23S (A2058 et A autres) + mutations L4 et L22 chez certaines souches. stratégie / nombre de copies : amorces spécifiques 3’ + amorce interne chez 6 souches : au moins la moitié des copies mutées (chiffres) Confirme résultats S. pneumoniae. certaines souches : accumulation importante de mutations (5B : 23) certaines : association de mutations dans le gène rrl (4A,4B / 5C, 5D, 5E) avec seule 2058 connue et 4A, 4B avec gène de résistance

25 Mutation du gène rrl Mutation successivement dans chaque copie
X 1 2 3 4 5 6 Mutation d’une copie puis transmission aux autres par conversion génique 2 manières d’accumuler des mutations : mute successivement chaque copie première mutation transmise par conversion génique par un processus de recombinaison intra chromosomique. X 1 3 5 2 4 6

26 Analyse du gène rrl quand 2 mutations adjacentes sont détectées
Souche Mutations Copie A Copie B Copie C Copie D Copie E Copie F 4A 2089C, 2207T wt 5C 2058G, 2207T 5D 5E séquence individuellement chaque copie pour vérifier mutations constamment associées sur une même copie tableau = association constante mutations répandues par conversion génique (lié à une recombinaison facilité?) Les mutations semblent s’être répandues par conversion génique entre les copies du gène rrl : recombinaison facilitée ?

27 Mutations des gènes domestiques
Détection d’altérations de gènes domestiques chez les souches accumulant de nombreuses mutations ribosomales : sodA : résistance au stress oxydatif spa : adhésion De plus, certaines souches avec nombreuses mutations ribosomales : altérations de gènes domestiques pourtant pas soumis à la pression antibiotiques : sodA et spa

28 Recherche de souches hypermutables parmi des isolats cliniques de S
Recherche de souches hypermutables parmi des isolats cliniques de S. aureus Toutes ces observations …

29 Proportion de souches hypermutables chez les S
Proportion de souches hypermutables chez les S. aureus isolés ou non de mucoviscidose 1 / 74: fréquence de mutation sur rifampicine > 10-7 13 / 89: fréquence de mutation sur rifampicine > 10-7 fréquence de mutation sur rifampicine : 89 souches muco contre 74 souches autres pathologies 74 : une seule fréquence de mutation augmentée 89 : 13 fréquence de mutation supérieure à 10-7 différence significative entre les deux échantillons ( Fisher) fréquences de mutation moyennes des deux groupes (Mann-Whitney) confirmés sur streptomycine ( différence significative) Cependant, inclus les 20 souches présentées précédemment, surprise : les souches avec un grand nombre de mutations ( structures ribosomales et gènes domestiques) : pas une fréquence de mutation particulièrement élevée. Test de Fisher (qualitatif): différence significative (p=0,0045) Test de Mann-Whitney (quantitatif): différence significative (p=0,05) Les souches résistantes aux macrolides isolées de mucoviscidose accumulant de nombreuses mutations (ribosome + gènes domestiques) n’étaient pas hypermutables ! Confirmé sur streptomycine

30 Analyse moléculaire de mutS et mutL chez les S. aureus cliniques
Gènes très conservés chez S. aureus 10 paires d’amorces définies Séquençage intégral de la région mutSL chez les mutateurs et chez 4 souches contenant de nombreuses mutations ribosomales étude moléculaire mutS et mutL sur souches cliniques deux gènes extrêmement bien conservés chez les 7 S. aureus deux gènes adjacents : 10 paires d’amorces séquence intégralement portion d’ADN chez mutatrices, mais aussi chez 4 non mutatrices résistantes aux macrolides avec nb mutations ribosomales.

31 Mutations de la cible des macrolides
Patient (Souches) Gènes de résistance ARNr 23S L4 L22 Domaine V Domaine II 1A 1B 1C, 1D - A2058T A2059G A2058G 2B 2C erm 3A 3C 3D 4 16 8 6 4A 4B msr(A) T2089C, C2207T 5B 5C, 5D, 5E C2163T A2058G, C2207T 7 14 1 6B 6C A2058G + 3 2 9 4 souches : asso gène de résistance et accumulation de mutations étude plus partic 3A et 5B.

32 Souches 3A et 5B Pas d’amplification avec les amorces mutSL
Le gène mutS est indétectable en Southern blot : A B C S 3A 5B S 3A 5B S 3A 5B S: souche de référence S. aureus RN4220 Hybridation avec une sonde rrl (contrôle positif) Électrophorèse sur gel d’agarose de l’ADN total restreint Hybridation avec une sonde mutS En effet : le plus grand nombre de mutations, 0 amplification par PCR Southern Blot a confirmé mutS indétectable électrophorèse en gel d’agarose de l’ADN total digéré contrôle positif d’hybridation avec une sonde rrl hybridation avec la sonde mutS : 0 avec 3A et 5B. Dans l’histoire naturelle … 2 souches sans mutS mais non hypermutables : l’étape ultime acquisition d’un phénotype mutateur par délétion de mutS : accumuler les mutations adaptatives Puis : mécanisme inconnu qui compense la perte de mutS Etape ultime de l’évolution des S. aureus isolés de mucoviscidose?

33 Altérations des protéines MutS et MutL
Souche Hypermutabilité MutS MutL 1A + délétion F488 à R528, T192A aucune UCN22 délétion 5060 pb (1900 pb mutS et tout mutL) UCN23 UCN24 UCN25 UCN26 UCN27 del L275 à R279 UCN28 Y314H UCN29 N181H, N373D, T415M, N588D, L811S, S814C N364D, S377R, N418D UCN30 UCN31 3A - délétion 3C N181H, S201P, N373D, T415M, V773G, G789D, L811S ND 4A 5B bilan des résultats séquençage mutSL souches cliniques En plus 3A et 5B, 4 autres souches MutS. 1A : 41 acides aminés + T192A PCR inverse UCN22 : délétion de 5060 pb (gde partie mutS + tout mutL) UCN29 : diverses substitutions (certaines aussi chez la souche 3C pas mutatrice) 4 souches MutL : en plus de UCN22, UCN27 : délétion de 5 acides aminés, et UCN28 et UCN29 : diverses substitutions six souches : aucune altération

34 Analyse des gènes mutS et mutL chez S. aureus
analyse plus générale

35 Le SRM des bactéries à Gram positif
Surtout étudié chez B. subtilis, L. monocytogenes, S. pneumoniae Corégulation des gènes mutS et mutL : opéron (B. subtilis, L. monocytogenes) séquences régulatrices similaires en amont (S. pneumoniae) surtout été étudié chez autres espèces gènes corégulés : opéron chez B. subtilis et L. monocytogenes, régions régulatrices chez S. pneumoniae

36 Analyse in silico de la région mutSL chez S. aureus
pBT1 (6.73kb) ? ΔG=-17.3 kJ/mol ? ΔG=-22.4 kJ/mol 302 pb 12 pb 14 pb 36 pb 348 pb glpF SA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP analyse in silico : région mutSL (figure, taille intergénique) Deux terminateurs putatifs inactivation de mutS (souche de référence S. aureus RN4220) RT-PCR pour confirmer opéron avec amorces (taille) U1S L4S (1993 pb) (8723 pb) U5S L1L (1211 pb) U5L glpL (717 pb) U1L L4L (1785 pb)

37 Analyse par RT-PCR de la région mutSL
SA1136 mutS (2619 pb) mutL (2010 pb) glpP HP glpF (1993 pb) (+pBT1 = 8723 pb) (1785 pb) (1211 pb) (717 pb) T S S S S électrophorèse gel d’agarose T = témoin négatif 42= ARN de 4220 S = ARN de la souche inactivée dans mutS. confirment opéron (chaque paire d’amorce = fragment taille attendue sur la souche de référence) inactivation de mutS effective (première amplif ne fonctionne pas) conditions pas adaptées à 9000 pb insertion de pBT1 : pas d’effet polaire majeur (amplifications suivantes positives) 2000 pb 1500 pb 1000 pb 500 pb

38 Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus
RN pORI23mutS mutS + pORI23mutS RN pORI23mutS1A mutS + pORI23mutS1A mutS + pORI23mutS29 RN pORI23mutS29 mutS + pORI23 RN pORI23 pORI23 pORI23mutS pORI23mutS1A pORI23mutS29 rôle de MutS dans l’hypermutabilité analysé in vitro + test fonctionnalité MutS mutées (souches cliniques) série de vecteurs, introduits dans la RN mutS mesure fréquence de mutation sur rifampicine.

39 Rôle de MutS dans l’hypermutabilité chez S. aureus
4 5 6 Log inverse des fréquences de mutation 7 résultats = graphique regroupés : souches de référence, souches inactivées dans mutS RN4220 seul, RN vecteur vide, RN mutS sauvage cloné deux dernières barres = deux gènes mutS mutés mutS grande délétion mutS différentes mutations toutes souches : fréquence basse (10-8 à 10-7). série de souches inactivées : même disposition souche sans vecteur, souche vecteur vide, souche mutS sauvage, puis deux gènes mutS mutés (fonctionnalité) Toutes souches : fréquence de mutation au moins dix fois sauf souche complémentée confirment que mutS = rôle dans l’hypermutabilité mutations détectées chez cliniques et testées = responsables de l’hypermutabilité (pas restauration un phénotype sauvage de mutS-) 8 9 pORI23 mutS pORI23 mutS1A pORI23 mutS29 mutS + pORI23 mutS mutS + pORI23 mutS1A mutS + pORI23 mutS29 pORI23 mutS + pORI23 4220 mutS

40 Rôle de MutL dans l’hypermutabilité chez S. aureus
3 4 5 Log inverse des fréquences de mutation 6 même analyse mutL graphique = résultats , même organisation mutL = impliqué hypermutabilité inactivation augmente fréquence de mutation augmentation fortement réduite par complémentation Deux gènes mutL mutés testés seule la délétion 5 acides aminés = responsable l’autre altération testée (plusieurs substitutions) ne permet pas de maintenir une fréquence élevée de mutL-. 7 8 pAT mutL pAT mutL27 pAT mutL29 mutL+ pAT mutL mutL + pAT mutL27 mutL + pAT mutL29 pAT392 mutL + pAT392 4220 mutL

41 Rôle de MutS et MutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (1)
RN4220 mutS mutL pBT1sodA (100%) pBT1sodA (97%) pBT1sodA (94%) pBT1sodA (87,5%) pBT1sodA (74%) pBT1sodA (82,3%) pBT1 (TS, CHLR) Également : rôle dans prévention recombinaison homéologue modèle d’étude in vitro plasmide thermosensible résistant au chloramphénicol : série de 6 vecteurs (fragment d’ADN avec pourcentage d’identité variables) (74% à 100%) constructions introduites RN4220 et dérivés 18 souches : estimation fréquence de recombinaison , 3 cultures Condition pour ne permettre qu’aux souches … 3 cultures successives à 42°C + CHL

42 Rôle de mutS et mutL dans la prévention de la recombinaison homéologue chez S. aureus (2)
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 S. aureus RN4220 Pourcentage d’identité avec sodA y=4.45x10-2X R²=0.9367 Survie après 3 cultures successives à 42°C (ratio de l’inoculum initial) 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 S. aureus mutL DNA sequence identity y=4.72x10-2X R²=0.7393 Survie après 3 cultures successives à 42°C (ratio de l’inoculum initial) Pourcentage d’identité avec sodA 1.4 y=4.18x10-2X R²=0.7726 S. aureus mutS graphique = résultats pour série RN4220 L’echelle % d’identité du fragment en abscisse estimation de la survie en ordonnées equation et cœfficient dans l’insert survie en relation directe avec la divergence de séquence entre l’insert et son homologue chromosomique Obs mise en relation avec des travaux précédents (E. coli et B. subtilis : diminution de la fréquence de recombinaison corrélée de façon linéaire avec le degré de divergence de séquence entre la donneuse et la receveuse) résultats mutS et mutL inactivation = pas effet significatif sur le processus de recombinaison analyse de variance ( F) pour chaque paire pour certaines souches, exp répétée 6 fois, résultats très hétérogènes : niveau de l’inoculum initial ou mourir indép taille inoculum résultats = barres d’erreurs dû à l’activation au hasard du système SOS? coefficient de corrélation diminué pour mutS et mutL effet limité de l’inactivation sur la recombinaison (cas pour B. subtilis)

43 Relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S
Relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S. aureus isolés de mucoviscidose (Transition)

44 Résistance à l’érythromycine
77 % chez les S. aureus hypermutables 50 % chez les S. aureus non hypermutables érythromycine = chef de file Analyse résistance mutateurs vs non mutatrices isolées de mucoviscidose 77% de souches résistantes H 50% chez les non H différence significative entre les deux groupes : affirmation « dans le cadre de la mucoviscidose… » Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes (p<0,05 Test de Fisher)

45 Sélection de clones résistants
4 5 Souches hypermutables 6 Log inverse des fréquences de mutation 7 Etude comportement vis-à-vis des macrolides de 3 mutateurs sensibles vs 2 témoins non H. fréquences sur l’érythromycine, l’azithromycine et télithromycine Fréquences moyennes des H sur ery et azi : plus élevées que non H ces deux antibiotiques sélectionnent Par contre, télithromycine beaucoup moins fréquences H/non H semblables différence de comportement due affinité particulière télithromycine pour ribosome (structure particulière)? confirment relation entre hypermutabilité et résistance aux macrolides chez les S. aureus hypermutables indique utilisation antibiotiques moins sélectionnants : évite l’apparition de résistance par mutation? 8 Souches témoins 9 10 Erythromycine Azithromycine Télithromycine

46 Conclusions (1) Mucoviscidose : résistance aux macrolides des S. aureus surtout due à des mutations de la cible ribosomale Au moins trois copies du gène rrl étaient mutées chez chaque mutant de l’ARNr 23S étudié La dissémination d’une mutation rrl entre les différentes copies du gène semble se faire par conversion génique Relation avec l’administration prolongée d’azithromycine aux patients atteints de mucoviscidose (?) En conclusion 1/ 2/ 3/ étude plus détaillée de certains mutants : dissémination semble se faire par conversion génique via recombinaison 4/ résultats liés à l’administration azithromycine dans mucoviscidose? : 7 / 9 patients prophylaxie , tous un ou plusieurs traitements curatifs

47 Conclusions (2) Ces observations pourraient être liées à une forte proportion de souches hypermutables chez les S. aureus dans la mucoviscidose: Les souches hypermutables sont plus fréquemment résistantes à l’érythromycine Les souches hypermutables sensibles aux macrolides acquièrent plus facilement une résistance par rapport aux souches sauvages L’utilisation de combinaisons d’antibiotiques semble nécessaire pour éviter l’apparition de souches hypermutables 1/ En effet, celles-ci plus fréquemment résistantes à l’érythromycine mutateurs sensibles acquièrent plus facilement une résistance 2/ hypothèse : l’administration de combinaisons d’antibiotiques nécessaire? utilisation de composés moins sélectifs préférable?

48 Conclusions (3) Spécificité de l’hypermutabilité des souches isolées de mucoviscidose ? Non : forte proportion de mutateurs dans d’autres pathologies (ex: ITU – Denamur et al., J. Bacteriol., 2002) Effets conjugués des pressions (antibiotiques + réponse immunitaire de l’hôte) : sélection de mutateurs Nos résultats + d’autres études suggèrent : l’hypermutabilité = spécificité des souches mucoviscidose Mais : fortes proportions détectées dans d’autres pathologies (ITU) détection de mutations dans gènes domestiques ( réponse au stress et adhésion) : les mutateurs pourraient être sélectionnés à cause des effets combinés des fortes pressions ( traitements antibiotiques + réponse immunitaire de l’hôte)

49 Conclusions (4) Rôle de MutS et MutL chez S. aureus : Perspectives :
Hypermutabilité : confirmé chez 4 souches cliniques Recombinaison : effet limité ? Perspectives : Autres gènes mutateurs chez S. aureus ? Relation entre hypermutabilité et évolution du génome de S. aureus ? Finalement, MutS et MutL impliquées dans l’hypermutabilité chez S. aureus. Confirmé : découverte chez 4 souches cliniques relation directe altérations et hypermutabilité rôle MutS et MutL dans recombinaison homéologue moins évident (autres mécanismes sont sans doute impliqués) Autres questions : autres gènes mutateurs (cause de l’hypermutabilité chez la majorité souches H?). récemment : souches de S. aureus = nombreuses divergences dans leur structures chromosomiques, survenue de souches particulièrement virulentes et résistantes du à un nombre important de séquences répétées : réorganisations génétiques importantes? Problème particulièrement aigu si recombinaisons illégitimes favorisées par H Etude de l’évolution génomique pathogènes H vs sauvages : éléments sur la relation entre les deux phénomènes + informations mécanismes sous-jacents

50 Hypermutabilité et adaptation chez les souches de Staphylococcus aureus isolées de mucoviscidose : rôle des gènes mutS et mutL et impact sur la résistance aux macrolides Anne-Laure PRUNIER Directeur de thèse : Pr. R. Leclercq Laboratoire Relations hôte et microorganismes des épithéliums, EA 2128 Faculté de médecine, Université de Caen Basse-Normandie