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ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU CALCIUM AU COURS DU DEVELOPPEMENT ET DE LA MATURATION DES NEURONES GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE SOURIS Présentée par.

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1 ROLE DE L'ACTIVITE DEPENDANTE DU CALCIUM AU COURS DU DEVELOPPEMENT ET DE LA MATURATION DES NEURONES GANGLIONNAIRES VESTIBULAIRES DE SOURIS Présentée par Laurence AUTRET Le 14 décembre 2005 Directeur de thèse : G. DESMADRYL Unité 583 INSERM, INM, Montpellier, France

2 Système vestibulaire Oreille interne Ganglion Vestibulaire Organe Vestibulaire Cochlée

3 Ganglion vestibulaire Le ganglion vestibulaire contient les corps cellulaires des neurones qui connectent les cellules sensorielles et les noyaux vestibulaires

4 Maturation du système vestibulaire

5 Canaux calciques dépendants du potentiel HAUT SEUIL BAS SEUIL 1 S 1 C 1 D 1 F 1 A 1 B 1 E Ca v1.1 Ca v1.2 Ca v1.3 Ca v1.4 Ca v2.1 Ca v2.2 Ca v2.3 Type L Type P/Q Type N Type R 1 G 1 H 1 I Ca v3.1 Ca v3.2 Ca v3.3 Type T Deux grandes familles de courants calciques déterminées par leur seuil dactivation Dans les courants calciques à haut seuil dactivation, plusieurs sous-types caractérisés par leur pharmacologie

6 Electrophysiologie

7 Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à haut seuil dactivation au cours du développement Les conductances de type L restent constantes au cours du développement. Les conductances de type N augmentent progressivement au cours du développement. Les conductances de type P présentent un pic dexpression à E17 puis diminuent au cours du développement. Les conductances de type Q augmentent jusquà la naissance puis restent constantes. J.Physiology 1999, Chambard and coll.

8 Evolution des courants calciques dépendants du potentiel à bas seuil dactivation au cours du développement Le nombre de neurones exprimant un courant de type T diminue au cours du développement. Ils ne sont que 20% à la naissance. Lorsque la conductance de type T est présente, elle est soit de forte amplitude soit de faible amplitude. J.Physiology 1999, Chambard and coll.

9 Développement du système vestibulaire et évolution des courants calciques de type T Lexpression des courants calciques de type T correspond à une période de pousse neuritique importante et de synaptogenèse Proportion de cellules exprimant un courant calcique de type T

10 I- Caractérisation des sous-unités calciques de type T présentes sur le soma du neurone vestibulaire primaire II- Etude de lactivité électrique III- Rôle sur la pousse neuritique in vitro

11 Quelles sont les ou la sous-unités impliquées dans la genèse du courant calcique à bas seuil dactivation? HAUT SEUIL BAS SEUIL 1 S 1 C 1 D 1 F 1 A 1 B 1 E Ca v1.1 Ca v1.2 Ca v1.3 Ca v1.4 Ca v2.1 Ca v2.2 Ca v2.3 Type L Type P/Q Type N Type R ? 1 G 1 H 1 I Ca v3.1 Ca v3.2 Ca v3.3 Type T

12 Caractérisation moléculaire par la technique de RT-PCR Les ARNm des trois sous-unités sont présents à E17

13 Caractérisation électrophysiologique Identification de deux populations de neurones en fonction de lamplitude du courant calcique de type T Neurones avec un grand courant : amplitude > 200 pA Neurones avec un petit courant : amplitude < 60 pA

14 Cinétiques dactivation et inactivation Cinétiques dactivation et dinactivation rapides des courants calciques de type T pour les deux populations de neurones : Ca v 3.1 and/or Ca v 3.2

15 Les neurones ayant un grand courant calcique de type T Constante de temps de déactivation= 5,28 ms à -60 mV et 0,52 ms à mV : Ca v 3.2 Constante de temps de réactivation= 1394 ms (lente) et 117 ms (rapide) : Ca v 3.2 IC 50 = 13,4 µM, grande sensibilité au Nickel : Ca v 3.2 La fraction majoritaire du courant calcique de type T est générée par Ca v 3.2

16 Identification dune nouvelle propriété de la sous-unité Ca v 3.2 : mécanosensibilité

17 Neurones vestibulaires ayant un grand courant calcique de type T Canaux calciques de type T recombinants Seule la sous-unité Cav3.2 présente une mécanosensibilité. Cet effet est réversible

18 Les neurones ayant un petit courant calcique de type T Les observations faites sur cette population de neurones sont similaires à celles obtenues après application de 10 µM de nickel sur la population de neurones ayant un grand courant calcique de type T Constante de temps de déactivation= 8,6 ms à - 60 mV et 1,1 ms à -140 mV Constante de temps de réactivation= 665 ms (lente) et 103 ms (rapide) Ce courant calcique de type T semble g é n é r é par Ca v 3.1

19 Quelle est limplication du courant induit par cette sous-unité dans la forme du potentiel daction? La sous-unité Ca v 3.2 est majoritairement présente sur le soma des neurones vestibulaires à E17 Conclusion Cette sous-unité sactive pour des potentiels proches du potentiel de repos de la cellule

20 Forme des potentiels daction enregistrés à E17 Potentiel daction suivi dune dépolarisation post potentiel (ADP) Potentiel daction avec un épaulement sur la phase de repolarisation Potentiel daction avec une repolarisation rapide et une hyperpolarisation post potentiel (AHP) Induit par Ca v 3.2 ?

21 Effet de lapplication de nickel sur les différentes formes de potentiels daction Le nickel induit une disparition de lADP Lactivation de ce courant calcique de type T généré par Ca v 3.2 induit une dépolarisation post potentiel Ni 2+

22 Etude du potentiel daction avec ADP ou potentiel daction calcique Corrélation entre la présence dun grand courant calcique de type T et une ADP suivant le PA Le blocage des autres conductances calciques sont sans effet sur le PA La TTX ne bloque pas la genèse du potentiel daction calcique Le grand courant calcique de type T est responsable de lADP ou PA calcique

23 Etude du potentiel daction avec épaulement Quelle conductance ionique induit un épaulement lors de la phase de repolarisation du potentiel daction au cours du développement ?

24 Etude du potentiel daction avec épaulement Applications de 1µM et 10 µM de nickel nont pas deffet sur lépaulement mais sur lADP Application de 100µM de cadmium inhibe lépaulement Application de 500 nM dω-agatoxine IVA (antagoniste de canaux de type P/Q) bloque lépaulement du potentiel daction L épaulement semble généré par un courant calcique de type P

25 Conclusion Ca v 3.2 génère un courant impliqué dans lactivité électrique Présence dune ADP et dans certains cas dun potentiel daction calcique. Augmentation de lexcitabilité cellulaire et entrée massive de calcium Rôle physiologique de cette activité électrique transitoire dans la neuritogenèse?

26 Modèle in vivo impossible Utilisation de culture de neurones vestibulaires primaires Pas de pharmacologie spécifique de ces canaux ioniques Utilisation de la stratégie antisens Rôle physiologique de ce courant calcique généré par Ca v 3.2

27 Principe de la stratégie antisens ADNc ARNm Hybride ARN-ADN pas de traduction Technique qui permet de vérifier leffet de la disparition dune protéine

28 Etude de la pousse neuritique Ca v 3.2Scramble Les antisens ont été incorporés dans les cellules en vert Les neurones sont marqués en rouge (neurofilaments)

29 Antisens anti Ca v 3.2 diminue la pousse neuritique Suppression du courant calcique de type T Diminution significative de la pousse neuritique dans les neurones transfectés avec loligonucléotide antisens de Cav3.2

30 Neurone vestibulaire Ca ++ Ca v 3.2 PA avec ADP Pousse neuritique Effet sur la formation des synapses?? Conclusion générale et perspectives

31 Faible amplitude de courant Cav3.2 Ca v 3.1 Apparition plus précoce dans le développement? PA avec épaulement P/Q ??? Rôle au cours du développement ? Maturation des conductances potassiques

32 Les oligonucléotides antisens sont dans le soma des neurones Neurofilaments sont marqu é s en rouge Les oligonucl é otides sont marqu é s en vert Les oligonucl é otides ont é t é int é gr é le soma des neurones vestibulaires Images confocal


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