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UMR BIOGECO INRA Pierroton- Equipe de Génétique Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à un stress osmotique Philippe CHAUMEIL.

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1 UMR BIOGECO INRA Pierroton- Equipe de Génétique Plasticité moléculaire de deux Ecotypes de pin maritime soumis à un stress osmotique Philippe CHAUMEIL 13 avril 2006

2 2 Pin maritime (Pinus pinaster (Ait.)) Aire naturelle 4 Millions hectares 25% production nationale de bois de résineux Sylviculture intensive peuplement monospécifique Âge de rotation : ans Pâte à papier Palettes emballages Bois dœuvre Construction En Aquitaine : Intérêt économique et écologique

3 3 Amélioration du Pin maritime - Rendement- Rectitude Gestion des ressources génétiques et création de variétés améliorées Gains supérieurs à 30 % 1960

4 4 Evolution du climat mondial automne +4°C Evolution des températures à léchelle du siècle Augmentation des températures estivales

5 5 -50mm -10mm +40mm -30mm Evolution des précipitations à léchelle du siècle Evolution du climat mondial Hivers plus humides Etés plus secs

6 6 Impacts climatiques Nécessité de prendre en compte ladaptation des variétés améliorées aux conditions climatiques à venir Précipitations annuelles -25%-50%-25% ha en dépérissement dans les landes

7 7 Des nouveaux critères à prendre en compte Adaptation à lenvironnement Améliorer la résistance à la sécheresse des variétés Développement durable du massif forestier 1995…..Recherche des déterminants génétiques de caractères adaptatifs : Etudes - Physiologiques - Génétiques - Moléculaires de la réponse au stress hydrique

8 8 Résistance à la sécheresse Quels sont les mécanismes de résistance à la sécheresse ? échappement évitement tolérance Stratégies de résistance :

9 9 Réponses physiologiques au stress hydrique Stress Hydrique Régulation stomatique Conductance hydraulique Développement racinaire Hormones du stress (ethylène, ABA, PA) Pin maritime Variabilité phénotypique (ex: pression de sève, transpiration, teneur en eau) Variabilité physiologique (ex gs, E, ψs, ψh, TRE, croissance …) Modélisation du bilan hydrique au sein dune parcelle Espèce évitante Variabilité de réponse à la sécheresse entre Ecotypes, + ou - tolérants

10 10 Approches physiologie / génétique Variabilité génétique et héritabilité de lefficacité dutilisation de leau ? Contrôle génétique de lefficacité dutilisation de leau : Détection de QTL Héritabilité du caractère Déterminisme génétique de la réponse au stress hydrique

11 11 Stress Hydrique Détoxification Chaperonne Osmorégulation Modification structurale Régulation transcription Transduction du signal 5 Modifications de lexpression des gènes : Réponses moléculaires au stress hydrique Plasticité du protéome (thèse de Costa) Plasticité du transcriptome (thèse de Dubos) Pin maritime

12 12 Diversité de réponse à la contrainte Il existe une diversité intra-spécifique pour le niveau de résistance à la sécheresse Phénotypes sensibles Phénotypes résistants Entre individus Entre populations

13 13 France Maroc 650mm 980mm Diversité de réponse chez le pin maritime Efficacité dutilisation de leau Tolérance 2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu

14 14 Origine de la variabilité phénotypique Quest ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

15 15 Origine de la variabilité phénotypique Quest ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

16 16 Plasticité phénotypique et moléculaire Plasticité phénotypique: capacité dun génotype à modifier son phénotype dans des environnements différents P = G + E + GxE PhénotypeGénotypeEnvironnement Interaction Par analogie… Plasticité moléculaire: capacité dun génotype à modifier lexpression de son génome dans des environnements différents

17 17 Origine de la variabilité phénotypique Quest ce qui détermine le phénotype ? P = G + E + GxE G: Composante génétique (héréditaire) soumise à la sélection naturelle E: Composante épigénétique: PLASTICITE G x E : interaction ( partie de la plasticité génétiquement contrôlée)

18 18 Les normes de réaction E G Unité Génétique (G) : [Individu ou Population/Ecotype ou espèce] P = G + E + GxE Une façon simple de représenter P La valeur P dun G au travers des E

19 19 Les normes de réaction Phénotype E1E2 1 seule Unité Génétique (UG) : [Individu ou Population/Ecotype ou espèce] P = G + E + GxE Détection de gènes de réponse au stress PLASTICITE Valeur adaptative de cette plasticité ?

20 20 ex: sensible vs résistant G Expression Env1Env2 Expression Env1Env2 G1 G2 E Expression Env1Env2 G+E Expression Env1Env2 G+E Expression Env1Env2 G+E+GxE Expression Env1Env2 GxE Les normes de réaction Au moins 2 Unités Génétiques (G) P = G + E + GxE

21 21 G Expression Env1Env2 Expression Env1Env2 G1 G2 E Expression Env1Env2 G+E Expression Env1Env2 G+E Expression Env1Env2 G+E+GxE Expression Env1Env2 GxE Les normes de réaction Mise en évidence de stratégies de réponses différentes entre les génotypes

22 22 Objectif Identifier les gènes impliqués dans ladaptation à la sécheresse chez le pin maritime Hypothèse : Les gènes qui présentent ces normes de réaction sont liés à ladaptation des populations à leur environnement

23 23 Questions de recherche 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique? 2. Est-il possible didentifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans ladaptation au stress hydrique?

24 24 Ressources nécessaires 1. Développement dune ressource génomique 2. Obtention du matériel végétal Pour répondre à ces questions 3. Acquisition des données dexpression du génome

25 25 Méthode : Création de banques dADNc et séquençage dEST Identification de la fonction des gènes Ressources nécessaires 1. Développement dune ressource génomique

26 26 Gènes exprimés : séquençage EST Extraction dARNm Séquences dADNc (EST) Banque dADNc Principe ? Quel matériel végétal utiliser pour une bonne représentativité des banques dADNc ?

27 27 Banques dADNc Xylème en différentiation Racines de plantules (Stress / Contrôle ) Les racines : 1 er organe à percevoir une sécheresse édaphique Rôle dancrage et de captage de leau et des nutriments Un type cellulaire majoritaire chez le pin (trachéides) Rôle de soutien et de conduction de leau et des minéraux Le bois : un bio-indicateur des conditions hydriques EST EST

28 28 Assemblage et annotation des Séquences EST CL1CL2CL3CL…CL10 CT12CT13CT14 CN56CN57 CN59 CN58 D2 Cluster Craw Phrap singletons - Création projet - Repeat masker - Assemblage Pipeline bioinformatique famille de gène ou gène Membres (paralogues) Allèles? Épissage? - Consultation - Étape dAnnotation Interface dannotation

29 EST assemblées en : Clusters Contigs Singletons Création dun Unigène de 7200 gènes : 4236 Singletons 2889 Consensus Réalisation dun Unigène

30 30 Doit permettre didentifier : Les gènes impliqués dans ladaptation au stress hydrique De détecter les gènes de la réponse précoce et ceux impliqués dans un stress établi 2. Obtention du matériel végétal Ressources nécessaires

31 31 Matériel végétal : 2 Ecotypes aux comportements tranchés 2 Ecotypes bien adaptés à leur milieu Gènes impliqués dans ladaptation au stress hydrique ? Gènes de la réponse précoce / gènes du stress établi ? 2 types de stress : - Court et violent - Prolongé et modéré

32 32 Choix dune culture hydroponique Matériel végétal : culture hydroponique Osmoticum = PEG

33 33 Stress court MPa Témoin court +2H +6H +24H +48H Application du stress Hydroponie Germination Stress Long MPa +3 semainesTémoin long Matériel végétal : Choix des conditions expérimentales

34 34 Matériel végétal : application du stress osmotique GerminationSalle de cultureEclairage Stress courtStress long témoin stress Traitement appliqué induit bien un stress Une différence entre Ecotypes en stress long Mesure du potentiel de base

35 35 Ressources nécessaires 3. Acquisition des données dexpression du génome 3.1. Réalisation dune puce à ADNc 3.2. Quantification de laccumulation des transcrits

36 36 Fabrication Réalisation dune puce à ADNc Gènes (EST) + lame de verre Dépôt« spotting »

37 37 Fabrication Réalisation dune puce à ADNc Gènes (EST) + lame de verre Dépôt« spotting » Ech 1 Analyse des résultats Hybridation et lecture Ech 2 Extraction des ARN Transcription des ARNm en ADNc et marquage Cy3Cy5 Hybridation

38 38 Quantification de laccumulation des transcrits: Plan dexpérience Choix du schéma dhybridation essentiel : dépend du nombre déchantillons à comparer détermine le coût de lexpérience doit permettre destimer les effets expérimentaux détermine la puissance de détection des variations dexpression Hybridations selon un « Loop design » Avantages Inconvénients Nb de lames réduit Estimation des effets plus précise Sensibilité aux données manquantes « loop » A BC A,B,C : 3 échantillons : lame

39 39 Pas de pont entre les 2 expériences Nombre de lames limité (30) Limiter le risque des manips Réponse « stress court » vs. « stress long » Témoin Stress 6hStress 48h Témoin Stress 6hStress 48h 18 lames Réponse à court terme Témoin Stress Témoin Stress 8 lames Réponse à long terme Quantification de laccumulation des transcrits: Plan dexpérience

40 40 3/ Obtention de données dexpression corrigées 2/ Normalisation inter-lames modèle global (gènes = répétitions) : résiduelle lame fluorochrome Biais techniques Écotype Condition Correction technique liée à lE et à la condition 1/ Normalisation intra-lame, « rlowess » (MAANOVA) : normalise signal Cy3/Cy5 tient compte de la position des spots Quantification de laccumulation des transcrits: analyse biométrique

41 41 Pour résumer… 1. Développement dune ressource génomique 2. Obtention du matériel végétal EST annotées et Unigène de 7200 éléments 2 Ecotypes x 5 conditions données ! 3. Acquisition des données dexpression du génome

42 42 Questions de recherche 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensible vs tolérant lors du stress hydrique? 2. Est-il possible didentifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans ladaptation au stress hydrique?

43 43 Question de recherche n°1 Méthode : Utilisation des données dexpression de puces à ADNc Détection des gènes différentiellement exprimés par ANOVA (effet Ecotype, effet environnement, interaction) 1. Quels sont les gènes différentiellement exprimés entre Ecotypes sensibles vs tolérants lors du stress hydrique?

44 44 Analyse de variance Détection des gènes différentiellement exprimés : part de variation expliquée par facteurs G + E + GE >40% ou 1/3 variation expliquée par un des trois facteurs seuil de probabilité de 0,01 pour au moins un des facteurs Ecotypecondition Effets techniques Prise en compte de la multiplicité des tests dans lerreur globale de type tests ! Utilisation de la méthode FDR: « False Discovering Rate »

45 45 Stress CourtStress Long effet significatif Condition (E)15%82% (504) Ecotype (G)64% (292)4% Ecotype+Condition (G+E)19%8% Interaction seule (GxE)0,2%0% Quels sont les effets significatifs majeurs ? Analyse de variance: résultats Nombre de gènes différentiellement exprimés : Expérience « Stress court » = 458 gènes Expérience « Stress long » = 612 gènes

46 46 Stress court = regroupement par Ecotype 458 gènes Stress long = regroupement par condition 612 gènes Regroupement des échantillons sur la base dune distance transcriptomique Euclidienne

47 47 1,25 1, Amplitude de régulation Amplitude de régulation : Stress CourtStress Long Ratios GEGE Gènes de fonctions connues pour leur implication dans la réponse au stress et de nombreux gènes de fonctions inconnues Ex: HSP, +6,62x Small HSP, +5,48x Protéines de membranes induites par lABA, +3,92x Déhydrine, +3,21 Précurseurs de peroxydases, -3,2 à -6,59x LEA, +3,02x HSP classe I, +4,16x Small HSP, +3,22x Flavonoid 3',5'-hydroxylase, +6,72x

48 48 Questions de recherche n°2 Méthode : Méthodes de regroupement des données 2. Est-il possible didentifier parmi ces gènes des groupes présentant des normes de réaction indiquant un rôle possible dans ladaptation au stress hydrique?

49 49 Méthodes visant à maximiser lhomogénéité intra-groupe et à minimiser lhomogénéité inter-groupe Agrégation des données (Clustering) Expander «Click » : Stress court Gènes différentiellement exprimés Stress Long Gènes différentiellement exprimés Clustering Regrouper les gènes dont le profil dexpression est similaire

50 50 Résultats 6 profils en « Stress Court » 7 profils en « Stress Long » 458 Gènes 612 Gènes Agrégation des données (Clustering)

51 51 Agrégation des données (Clustering) Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » Tc 6H 48H TL SL Cluster 1 :181Cluster 2 :107 Cluster 3 :70Cluster 4 :33 Cluster 5 :23Cluster 6 :22 Cluster 1 :219Cluster 2 :192Cluster 3 :41 Cluster 4 :39Cluster 5 :34Cluster 6 :29 Cluster 7 :21

52 52 Existe-t-il des gènes caractéristiques de la plasticité moléculaire ? Agrégation des données (Clustering) Expression Ctrl Stress E1 E2 E Réponses similaires entre Ecotypes = gènes à comportement plastique

53 53 Agrégation des données (Clustering) Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » Tc 6H 48H Profil « Condition » TL SL 45 gènes 411 gènes Expression Ctrl Stress E1 E2

54 54 Gènes régulés par le stress quel que soit lEcotype Expression CtrlStress E1 E2 Détection des gènes classiquement décrits lors du stress hydrique Déhydrine Protéines de réponse à léthylène HSP ASR LEA protéine à 7 domaines transmembranaires récepteur protéine kinase … Ex : Permettent détudier les mécanismes de la réponse au stress

55 55 Variabilité entre Ecotype Existe-t-il des gènes caractéristiques des Ecotypes ? G Expression CtrlStress

56 56 Quelle est lorigine de la différence de régulation entre populations différentes ? Dérive génétique Sélection naturelle Écotype marocain exposé à une sécheresse chronique Différentiel dexpression peut apporter un avantage sélectif Variabilité entre Ecotype Gènes de ladaptation ?

57 57 Agrégation des données (Clustering) Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » TL SL Profil « Écotype » Tc 6H 48H Expression CtrlStress

58 58 Gènes différenciant les deux Ecotypes Hypothèse : Stratégies adaptatives différentes Ex:Ecotype français : PAL Pectates lyases Glucane endo-1,3-beta glucosidase Bétaïne-aldéhyde déshydrogénase Composition des parois Osmoprotection Expression CtrlStress Ecotype marocain : Glutathione transférase Précurseur de la peroxydase Thioredoxine type H Peptidyl prolyl Isomérase Carbonate déshydratase Proton-exporting ATPase Détoxification Transport ionique Stabilisation protéique Expression CtrlStress

59 59 Gènes impliqués dans ladaptation Quels sont les gènes qui montrent des stratégies de réponse au stress (E) différentes entre Ecotypes (G) ? H0: gènes potentiellement impliqués dans ladaptation au stress hydrique Expression Env1Env2 G+E Expression Env1Env2 G+E+GxE Expression Env1Env2 GxE

60 60 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » TL SL Profil « Ecotype + Condition» TL SL Tc 6H 48H Gènes impliqués dans ladaptation

61 61 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » TL SL Tc 6H 48H Gènes plus fortement exprimés chez lEcotype marocain Gènes impliqués dans ladaptation

62 62 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » TL SL Tc 6H 48H gènes surexprimés par le stress, + Marocains Gènes impliqués dans ladaptation

63 63 Expression CtrlStress Ex : Gènes surexprimés, plus fortement exprimés chez lEcotype marocain Protéines de choc thermique (HSP), protéine induite par l ABA, LEA, Métallothionéines, Synthèse flavonoïdes… Réponse au stress Régulation de lexpression et synthèse des protéines Phospholipase D RING finger, Zinc finger, G-box binding factor, Histone H4 Elongation factor 1-gamma, … Composition parois Cellulose synthase Elastine-like Caractéristique de la réponse de lEcotype marocain ? Gènes impliqués dans ladaptation

64 64 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » gènes surexprimés par le stress, + Français Gènes impliqués dans ladaptation

65 65 Expression CtrlStress Ex : Gènes surexprimés, plus fortement exprimés chez lEcotype français Peptides antimicrobiens, Aluminium- induced protein-like, précurseur de péroxydase, cytochrome P450, protéines chaperonnes dnaJ… Réponse au stress + fonction inconnue + métabolisme Stratégie de maintien du métabolisme ? Gènes impliqués dans ladaptation

66 66 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » Tc 6H 48H sous-expression, Ecotype marocain plus exprimé Gènes impliqués dans ladaptation

67 67 Expression CtrlStress Ex : Gènes sous-exprimés lors du stress, Niveau dexpression maintenu plus élevé chez lEcotype marocain Isopentenyl-diP delta-Isomérase 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-diP synthase Geranyl diP synthase Pinène synthase Synthèse des terpènes Cholinephosphate cytidyltransférase B Précurseur Bétaïne Bétaïne-aldéhyde déshydrogénase, plus exprimée chez lEcotype français Stratégies de régulation différentes de la Bétaïne ? Gènes impliqués dans ladaptation

68 68 Expérience « Stress court »Expérience « Stress Long » TL SL sous-expression, Ecotype français plus exprimé Gènes impliqués dans ladaptation

69 69 Expression CtrlStress Ex : Gènes sous-exprimés lors du stress, mais plus exprimé Ecotype français Metallothionein-like protein EMB30 Disease resistance response protein Dehydratation stress-induced protein Réponse au stress Synthèse lignine C4H Caffeate O-methyltransferase PAL est également plus exprimée chez lEcotype français quelque soit condition Stratégies de régulation composition des parois différentes ? Gènes impliqués dans ladaptation

70 70 Gènes impliqués dans ladaptation Il existe dautres normes de réaction…

71 71 Gènes impliqués dans ladaptation 41 gènes 12 accessions de Pinus taeda 24 accessions très faiblement régulées 5 accessions à profil intéressant Alcool déshydrogénase Inositol oxygénase Germin (oxalate oxidase)-like Fonction inconnue Métallothionéine - like G+E+GxEGxE

72 72 Synthèse: des gènes candidats de ladaptation Copyright © Pearson Education, Inc., publishing as Benjamin Cummings. IPP isomérase GPP synthase Pinène synthase PAL C4H COMT Pectate lyase Glucan endo1,3 beta glucosidase Cellulose synthase Elastine-like PAROIS Histone H4 RING finger Zinc finger G-box binding factor Elongation factor 1 G Peptidilprolyl isomérase Régulation Expression Carbonate déshydratase Proton exporting ATPase Choline-P cytidyltransférase Bétaine aldéhyde desH 2 Bétaine Osmorégulation DETOXIFICATION Peptide antimicrobien Aluminium induced prot-like Précurseur peroxydase Cytochrome P450 Protéine chaperonne dnaJ Inositol oxygenase HSP ABA induced protein LEA Métallothionéines Synthèse flavonoïde Métallothionéines Disease resistance Dehydratation stress-induced S T R E S S

73 73 Conclusions THESE 1. Génération et mise à disposition dune ressource dEST annotées EST de racines 9000 EST de xylème 8000 EST de bourgeons = EST de pin maritime Outil dassemblage et dannotation (EPA)

74 74 Conclusions THESE 1. Génération et mise à disposition dune ressource dEST annotées 2. Production et utilisation dune puce à ADNc pin maritime Première fois chez cette espèce Maintenant, Unigène de gènes

75 75 Conclusions THESE 1. Génération et mise à disposition dune ressource dEST annotées 2. Production et utilisation dune puce à ADNc pin maritime 3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL Fort effet Ecotype en stress court et fort effet condition en stress long

76 76 Conclusions THESE 1. Génération et mise à disposition dune ressource dEST annotées 5. Possibilité de stratégies de réponses différentes 2. Production et utilisation dune puce à ADNc pin maritime 3. Détection de 458 gènes dans le SC et 612 gènes dans le SL 4. Détection de gènes potentiellement impliqués dans ladaptation au stress hydrique Gènes candidats potentiels

77 77 Perspectives Validation de gènes par qPCR sur plus dEcotypes qPCR= technique adaptée pour les études ciblées (beaucoup de pop et peu de gènes) Différence dexpression entre Ecotypes plantés au champ et mesurés pour lefficacité dutilisation de leau T29M8.12 protein (monooxygenase /disulfide oxidoreductase ) En cours … Test de provenance

78 78 Perspectives Étudier la diversité nucléotidique pour un lot de gènes potentiellement liés à ladaptation et analyser si la diversité observée est compatible avec un effet de la sélection naturelle (thèse en cours E Eveno, sur létude des patrons de diversité au sein de gènes candidats) Glycin-Rich Protein Caffeoyl-CoA-3-O-methyltransferase Arabinogalactan /Prolin-Rich Protein Trans-cinnamate-4-hydroxylase (C4H) Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase putative dehydrin

79 79 Perspectives Caractériser la composition chimique des parois (coopération ISA Lisbonne) …en cours… min cellulose témoin TC TL TC

80 80 Remerciements Christophe Plomion Patrick Léger Céline Lalanne Manon Moreau Christophe Boury Jean-marc Frigério … Johan Petit Virginie Garcia Silvia Fluch Marie Foulongne Aurélien Barré Nacer Mohellibi … Membres du jury : O. Brendel, P. Dizengremel, B. Garbay, P. Label, M. Zivy


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