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Diversité et étude des métabolismes microbiens de larsenic dun ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68) Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier.

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1 Diversité et étude des métabolismes microbiens de larsenic dun ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68) Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010 Laboratoire Interaction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes LIEBE UMR 7146 GDR 2909: Métabolisme de larsenic chez les Procaryotes

2 As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que lAs (V) 2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate Toxicité de larsenic Pit Aqp As III As V SH Phosphorylation As V Pst

3 Les métabolismes bactériens influencent le statut Redox de larsenic Métabolismes énergétiques - Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final de - en anaérobie gènes arr - Oxydation de larsenic: As (III) donneur de - gènes aox/ aro/ aso Métabolismes de résistance et de tolérance - Méthylation de larsenic: production despèces généralement moins toxiques dont certaines volatiles gènes ars M - Oxydation de larsenic: As (III) est oxydé en As (V) gènes aox - Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis sortie de lAs (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)

4 Illustrations: Silver et Phung,2005 Réduction / expulsionOxydation Métabolismes de détoxification

5 Etude de la diversité des microorganismes capables de métaboliser larsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines qui présente des conditions moins extrêmes que des sites précédemment étudiés comme Carnoulès. Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus élevée. But de létude: Comprendre le rôle des microorganismes dans la spéciation de larsenic en milieu faiblement contaminé.

6 Site détude: Sainte Marie aux Mines, 68. pH 6,9 / Carnoulès pH 3 Concentration en arsenic dans leau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L Concentration dans le sédiment mg/kg Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg) Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)

7 Prélèvement du sédiment Isolement souches cultivablesExtraction ADN total Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification PCR de lADNr 16S bactérien Etude de la diversité archéale par amplification de lADN r 16S archée Démarche expérimentale Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes aox et transporteurs

8 Résultats: Diversité taxonomique Diversité bactérienne des isolats cultivable Diversité bactérienne totale Diversité archéale

9 Diversité bactérienne des isolats cultivables 157 isolats aérobies55 isolats anaérobies 212 isolats

10 Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés) Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3% (Thèse Giloteaux, 2009)

11 Diversité archéale (83 clones séquencés) Diversité significative dArchées A Carnoulès uniquement Euryarchaeota amplifiés à partir déchantillons deau (Bruneel et al., 2008)

12 Résultats: Diversité fonctionnelle Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats Gènes de transporteurs + gènes aox Diversité totale des gènes aox Alignement des séquences des souches cultivables + clones

13 Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats arsB- 59 isolatsacr3(1)- 75 isolats acr3(2)- 11 isolatsaox- 22 isolats Transporteurs darsénite Oxydation Analyse croisée Aucun gène de résistance: 38 1 gène de résistance: gènes de résistance: 26 3 gènes de résistance: 7 A déterminer: 41

14 Diversité des gènes aox Pas de gène aox affilié aux archées Pas daox affiliés aux Gammaproteobactéries amplifiés à partir du sédiment Présence de clones sans représentants cultivables associés Présence chez Gram + et Flavobactéries Possibilité de transferts horizontaux (souches soulignées)

15 Conclusion et perspectives Mise en évidence dans le milieu dorganismes capables de réduire/ oxyder larsenic. Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation) Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions : -Différentes phase minérale - pH - Statuts redox - As (III)/As (V) - Donneur/ Accepteur de- Suivi de lexpression des gènes fonctionnels et de la spéciation de larsenic

16 Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

17 Physicochimie du site: (eau et sédiments) WaterSediments pH6.9- Density (Kg/l)-2.07 Moisture 20° (%)-18 Moisture 105° (%)-19.3 Fraction <2mn (%)-57.8 Fraction >2mn (%)-42.2 OM on <2mn (%)-2 P total-0.08 Al98 µg/l15150 µg/g As6 µg/l320 µg/g CdND0.3 µg/g CrND40 µg/g Cu1 µg/l103 µg/g FeND23745 µg/g MnND510 µg/g NiND23 µg/g PbND49 µg/g Zn2 µg/l88 µg/g pH (6,9) proche de la neutralité (diffère par rapport aux autres sites détudes) Concentration en arsenic faible dans leau (6 µg/L) et modérée dans sédiment (320 mg/kg) mais plus élevée que la concentration moyenne provenant du fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg). Contamination en Aluminium et en Fer non négligeable dans sédiments.

18 Résultat de diversité des gènes de transport darsénite Pas de gènes dArchées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Séquences ars B clonées et isolats phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence par clonage de nouveaux groupes sans représentants cultivables Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés. 2 clusters: le premier associé aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes. Divisé en deux clusters: Premier cluster: Actinobactéries (clones et isolats) et Gemmatimonadetes (clones). Second cluster: Bacteroidetes (isolats), Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones), et Gammaproteobactéries. Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. Même si phylogénie respectée par rapport au 16S cas de transferts horizontaux ars B acr3(1) acr3(2)

19 Diversité des gènes arsB Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Séquences ars B clonées proviennent des mêmes groupes que les isolats porteurs de arsB phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence de nouveaux groupes sans représentants cultivables par clonage Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés. Pas de gènes dArchées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

20 Diversité des gènes acr3(1) (1/2) Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones). Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries, Betaproteobactéries et Flavobactéries. Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Actinobactéries

21 Diversité des gènes acr3(1) (2/2) Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Bacteroidetes Verrucomicrobia Cloroflexi- Deltaproteobactéries Gammaproteobactéries Second cluster, comprenant les Bacteroidetes, Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones), et Gammaproteobactéries. Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés. Cas de transferts horizontaux Phylogénie conservée par rapport au 16S. Pas de gènes dArchées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

22 Diversité des gènes acr3(2) 2 clusters: le premier composé des acr3(2) associés aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones). Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes. Pas de gènes dArchées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces. Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes Proteobactéries Verrucomicrobia


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