La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

Etude de la Cytotoxicité Etude de la Cytotoxicité Chapitre 2.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "Etude de la Cytotoxicité Etude de la Cytotoxicité Chapitre 2."— Transcription de la présentation:

1 Etude de la Cytotoxicité Etude de la Cytotoxicité Chapitre 2.

2 Dune manière générale, linteraction dun toxique avec un système cellulaire induit en fonction de la dose et du temps dexposition des modifications allant des perturbations les plus bénignes jusquà linduction de lésions létales et la mort de la cellule. Dune manière générale, linteraction dun toxique avec un système cellulaire induit en fonction de la dose et du temps dexposition des modifications allant des perturbations les plus bénignes jusquà linduction de lésions létales et la mort de la cellule. La Cytotoxicité désigne lensemble des modifications et altérations à léchelle des macromolécules et des organites cellulaires : Etude de la toxicité cellulaire. La Cytotoxicité désigne lensemble des modifications et altérations à léchelle des macromolécules et des organites cellulaires : Etude de la toxicité cellulaire.

3 Réponse moléculaire dadaptation(induction des Hsp) Réponse moléculaire dadaptation (induction des Hsp) Perturbations cellulaires subléthales, réversibles (pHi, ions) Activation de mécanisme intrinsèque de mort cellulaire Apoptose Echec total de lhoméostasie : Nécrose Temps/ dose

4 Types de réactions entre toxique et cibles moléculaires 1. 2.

5 etyihbjhb

6 Effets des toxiques sur les molécules cibles 3. 1.

7 etyihbjhb

8 Analogues de purines : Analogues de purines : exemple: 6 mercaptopurine, qui inhibe la transformation de lIMP en AMP et sans AMP pas dacides nucléiques Analogues de métabolites Exemples de dysfonctionnement : Inhibition de la synthèse de lADN

9 Analogues de pyrimidines Analogues de pyrimidines Exemple: 5-Fluoro uracile, qui inhibe la transformation de lIMP en AMP et sans AMP pas dacides nucléiques Uracile + PRPP UMP dFUMP … UDP dUDP dUMP dTDP ADN

10 4. 2. Inhibition par pontage de base du DNA Exemple : le cis platine réactif bifonctionnel, - réactif bifonctionnel, - forme des liaisons stables en pontant: * 2 guanines sur un brin de lADN (60%) * 1 guanine et 1 adénine sur un brin de lADN (20%) * 2 guanines entre 2 brins dun DNA (20%) Le cis platine guérit 95% des cancers du testicule Le transplatine na pas dactivité antitumorale Le transplatine na pas dactivité antitumorale

11 4. 3. Inhibition par désactivation de DNA polymérase Les DNA polymérase possèdent 1 ou plusieurs thiols -SH positionnés dans des régions stratégiques des enzymes dans des régions stratégiques des enzymes - Plusieurs toxiques agissent sur les thiols et inactivent ces polymérases Exemple : les sels de métaux lourds Pb, Hg, Cd Inhibition par action sur les topoisomérases Ce sont des enzymes qui catalysent la relaxation du DNA super enroulé - Ce sont des enzymes qui catalysent la relaxation du DNA super enroulé - Il existe 2 classes de topoisomérases I et II Se fixe au DNA coupe lun des 2 brins reste fixée Se fixe au DNA coupe lun des 2 brins reste fixée Le DNA peut alors se dérouler, lenzyme qui reste attaché assure la ligation

12 Plusieurs toxiques peuvent agir sur les topoisomérases, les inactivant et bloquant la réplication Exemple1 : la camptothécine : activité anti-tumorale (cancer du colom, du sein) Campothécine

13 Analogues dintermédiaire du cycle de Krebs : Exemple: Acide Fluoroacétique (F-CH2-COOH) sengage dans le cycle de Krebs se transforme en acide fluorocitrique qui inhibe laconitase et bloque ainsi le cycle de Krebs Exemple: Acide Fluoroacétique (F-CH2-COOH) sengage dans le cycle de Krebs se transforme en acide fluorocitrique qui inhibe laconitase et bloque ainsi le cycle de Krebs Cycle de Krebs Exemples de dysfonctionnement (ii):

14 Cycle cellulaire/ Génotoxicité Atteintes à la membrane Stress oxydant Epigénétique Métabolisation Santé mitochondriale Apoptose / Nécrose Cytosquelette s Prolifération Mécanismes de cytotoxicité Mécanismes de cytotoxicité Signalisation Cellulaire

15 Étude de la Mort cellulaire Étude de la Mort cellulaire Chapitre 3.

16 Réponse moléculaire dadaptation(induction des Hsp) Réponse moléculaire dadaptation (induction des Hsp) Perturbations cellulaires subléthales, réversibles (pHi, ions) Activation de mécanisme intrinsèque de mort cellulaire Apoptose Echec total de lhoméostasie : Nécrose Temps/ dose

17 Mort cellulaire Non-programéeProgramée NécroseFormes « classiques » -apoptose -autophagique Formes atypiques -parapoptose -AIF-PARP-dépendante -Oncose

18 La mort cellulaire 2 types de mort cellulaire : apoptose Nécrose Apoptose = Mort cellulaire « programmée » ou « Programmed Cell Death » (PCD) PCD = phénomène essentiel dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques

19 Rôles de la mort cellulaire Elimination des « surplus » de cellules saines : Embryologie (cavités, morphogénèse, structures vestigiales, cellules « en trop ») homéostasie = constance de la masse cellulaire processus physiologiques (cellules mammaires, endomètre, cellules épithéliales…) Suppression des cellules endommagées (défauts génétiques, vieillissement, maladies, agents toxiques…) Régulation des populations cellulaires (ex. élimination régulée de certaines populations cellulaires immunitaires)

20 Nombre de cellules dans lorganisme : Nombre de cellules dans lorganisme : Durée de vie d une cellule Durée de vie d une cellule très variable selon l origine très variable selon l origine vie post-embryonnaire 200 types de cellules possédant toutes une durée de vie différente vie post-embryonnaire 200 types de cellules possédant toutes une durée de vie différente Cell. Intestinales 1 semaines Cell. Intestinales 1 semaines Erythrocyte 120 jours Erythrocyte 120 jours Cell. Hépatiques1 ½ an Cell. Hépatiques1 ½ an Cell. Osseuses25-30 ans Cell. Osseuses25-30 ans Neurones, Cell. Cardiaques, rétine, ne sont jamais remplacées Neurones, Cell. Cardiaques, rétine, ne sont jamais remplacées Apoptose Homéostasie Tissulaire

21

22 Importance de lapoptose Homéostasie cellulaire, développement embryonaire, synapse système immunitaire … Homéostasie cellulaire, développement embryonaire, synapse système immunitaire … Trop dapoptose : maladie dégénératives Trop dapoptose : maladie dégénératives Trop peu dapoptose: Cancer, maladies autoimmunes Trop peu dapoptose: Cancer, maladies autoimmunes

23 Fonction de lapoptose: Régulation de lhoméostase tissulaire ProliférationApoptose Prolifération apoptose Apoptose prolifération Homéostasie Sydromes proliferatifs CANCERAutoimmunité Inféctions virales Perte tissulaire MALADIES DEGENERATIVES SIDAischémie

24 Pathologies associées à l apoptose Apoptose excessive Alzheimer Parkinson SIDA Hépatites Certains diabètes Malformations Rejet de greffe virus, bactéries Toxines Apoptose insuffisante Maladies autoimmunes Leucémies Syndromes lymphoprolifératifs Tumeurs Ostéoporose Malformations Rejet de greffe Maladies virales (poxvirus, adenovirus) Maladies parasitaires (Toxoplasmose, Leishmaniose)

25 Apoptose et Nécrose Leurs mécanismes et modalités de déclenchement la morphologie des cellules les conséquences tissulaires leurs significations biologiques Se différencient par :

26 NECROSE La nécrose est une mort anormale accidentale de la cellule (cf. apoptose) La nécrose est une mort anormale accidentale de la cellule (cf. apoptose) Causes possibles : Causes possibles : Perte de lhoméostasie cellulaire Perte de lhoméostasie cellulaire Réduction de lafflux sanguin Réduction de lafflux sanguin Trop peu doxygène dans le sang Trop peu doxygène dans le sang Toxines, trauma, radiation, T°, etc.. Toxines, trauma, radiation, T°, etc.. Conséquences : Conséquences : Les cellules gonflent, éclatent et relarguent leurs contenus dans les espaces interstitiels Les cellules gonflent, éclatent et relarguent leurs contenus dans les espaces interstitiels Importante réaction inflammatoire Importante réaction inflammatoire

27 Fonctions cellulaires altérées Dérégulation de la perméabilité membranaire et donc influence les mécanismes de transport Dérégulation de la perméabilité membranaire et donc influence les mécanismes de transport Réduction du métabolisme cellulaire Réduction du métabolisme cellulaire Plus de synthèse protéique Plus de synthèse protéique Dommage au lysosomes : fuite denzyme dans le cytoplasme Dommage au lysosomes : fuite denzyme dans le cytoplasme Destruction des organelles cellulaires Destruction des organelles cellulaires

28 APOPTOSE Caractéristiques dune cellule en apoptose Caractéristiques dune cellule en apoptose Condensation cellulaire Condensation cellulaire Condensation de la chromatine Condensation de la chromatine Fragmentation de lADN Fragmentation de lADN « blebbing »de la membrane « blebbing »de la membrane Exposition sur la membrane externe des phosphatidylserine Exposition sur la membrane externe des phosphatidylserine Sécrétion de cytokines qui inhibe linflammation Sécrétion de cytokines qui inhibe linflammation Ces caractéristiques sont régulés par des signaux Ces caractéristiques sont régulés par des signaux

29 Apoptose vs Nécrose Atrophie Intégrité organelles et membrane Condensation du noyau Bourgeonnement de la membrane Fragmentation :corps apoptotiques Phagocytose / C voisines Pas d inflammation Turgescence Lyse des organelles et des membranes Pas de condensation Rupture des membranes Libération du contenu cellulaire Lyse de la chromatine Phagocytose tardive Inflammation

30 APOPTOSE versus NECROSE

31 BLEBBING DES CELLULES

32

33 AUTOPHAGIE Sorte de « self » cannibalisme Sorte de « self » cannibalisme Manque de nutriment Manque de nutriment Digestion dorganelle intracellulaire Digestion dorganelle intracellulaire Réarrangement de la membrane séquestration des composants dans des autophagosomes puis fusion avec lysozomes (dégradation enzymatique) Réarrangement de la membrane séquestration des composants dans des autophagosomes puis fusion avec lysozomes (dégradation enzymatique)

34 Formes de mort cellulaire Apoptose Autophagie Morphologie:condensation chromatine Vacuoles autophagiques fragmentation nucléaire corps apoptotiques Initiateurs:Death receptors déplétion en sérum, acides aminés Endommagement DNA infection virales, déplétion en facteurs de croissance Médiateurscaspases, protéines BH1-3, BH3JNK1? MKK7? Inhibiteurs:inhibiteurs caspases, protéines BH1-4inhibiteurs JNK? PCD I PCD II

35 Radiation toxines Dépletion en fac- teurs de croissance Interactions récepteurs-ligands e.g. TNFR-TNF, Fas-FasL Lymphocytes cytotoxiques Regulateurs IS Bcl2Bax BclxBadautres Adaptateurs caspases initiatrices Caspases executrices Granzyme B Fragmentation du DNA Dégradation du cytosquelette Activation des endonucléases DNA p53

36 Apoptose: les 2 voies Voie extrinsèqueVoie intrinsèque (Récepteurs)(Mitochondrie) Activation de récepteurs - Activation de récepteurs proapoptotiques (p.ex Fas) -Sécrétion de molécules proapoptotiques par les cellules du système immun (lymphocytes T cytotoxiques) -Activation de médiateurs associés aux membranes mitochondriales (Bcl2) Activation des caspases

37 Différences entre les deux voies Mitochondriale Mitochondriale Médiée par le stress (toxiques, rayonnements, …) Médiée par le stress (toxiques, rayonnements, …) Synthèse de protéines pro- et anti-apoptotiques Synthèse de protéines pro- et anti-apoptotiques heures heures Récepteurs (Fas, TNFR, TRAIL) Récepteurs (Fas, TNFR, TRAIL) Pas de synthèse de protéines Pas de synthèse de protéines Très rapide qqs heures Très rapide qqs heures

38 La voie de mort récepteur dépendant Les récepteurs de mort sont placés dans les membranes et détectent les signaux extracellulaires et initie rapidement la machinerie apoptotique. Lactivation des récepteurs par fixation de leurs ligands FasL, TNF, provoque lactivation du domaine intra-cytoplasmique « Death domain » et active les caspases initiatrices qui à leur tour activent les caspases exécutrices.

39 La voie mitochondriale La mitochondrie : engins de la mort Molécules pro-apoptotiques relâchées par les mitochondries: -Apaf-1 -cytochrome c -smac/DIABLO -Omi -AIF (apoptosis-inducing factor) Régulation de la fonction pro-apoptotique des mitochoindries: -Famille de Bcl-2

40 proApoptotique ou antiApoptotique) Bax Bak Bok Bik Bin Bad Bid… Bcl2* Bclxl* Bclw (*= inhibe Caspase9) Formation homodimères ou hétérodimères Régulation: balance entre mort et survie cellulaire) Action sur les membranes Mitochondriales = lib é ration ou non du cytochrome C La famille Bcl2, B-cell Lymphoma-2 (bcl-2)

41 Homodimérisation/Hétérodimérisation

42

43 1- Stress Proapoptotique > Antiapoptotique: 2- Ouverture des pores mitochondriaux 3- Relargage du Cytochrome C 4- Fomation de lapoptosome 5- Activation des Caspases Exécutrices (caspase 3) 6- Apoptose + - Pro-caspase 9 Apaf-1 Cytochrome c Bcl-2 Bax Matrice mitochondriale MPT mb interne mb externe apoptose

44 (AIF) m Cytochrome C dATP Apaf-1 Pro Cas 9 Cyt C Caspase 9 AIF = Apoptosis Inducing Factor Apaf-1 = Apoptosis protease activating factor 1 Apoptosome Caspase 3

45 Voies de mort : la voie mitochondriale et la voie des recepteurs Apoptosome Cell stress: oxidants, toxiquesFas L TNFa TNFR1 Fas/CD95Mitochondrion Bax/BcL2 MPT Cyt c Apaf-1 Caspase-9 Procaspase-9 Caspase effectrice (e.g. caspase-3) APOPTOSIS Caspase-8 Death domains

46 Deux voies majeures dapoptose Cory and Adams, 2002

47 Les Caspases Cystéine protéase sont synthétisée à létat de précurseur Comment les caspases tuent la cellule Destruction de protéines indispensable a la vie de la cellule Régulation des caspases : activation en cascade, IAP inhibiteur de caspase

48 14 caspases et pro-caspases Cystéines protéases, résidus acide aspartique 3 groupes, selon affinité de substrat I = 1, 4, 5 ---> inflammation II= 2, 3, 7 + CED-3 ---> apoptose III = 6, 8, 9 ---> « Les Caspases: C aspases la caspase 3 exécuteur-clé (qq soit le stimulus)

49 Caspase activation Pro-domain large subunit small subunit Inactive Active Auto-cleavage or cleavage by other caspases

50 Substrats des caspases Plus de 250 protéines identifiées: Protéines impliquées dans: - la structure du cytosquelette; - la signalisation; - la régulation de la transcription; - le cycle cellulaire; - la réplication et la réparation du DNA.

51 Condensation et fragmentation du noyau: ICAD CAD Fragmentation du noyau CAD = caspase-activated Dnase = DFF 40 (DNA fragmentation factor) Caspases

52 Phase de résolution Caspases activation phospholipase A2 Sécrétion de médiateurs dattraction lipidiques attraction de macrophages Phagocytose et élimination des cellules apoptotiques

53 Phosphatidyl serine DNA degradation Membrane blebbing Cytoskeletal remodeling CED-10 RAC-1 CED-12 ELMO CED-5 DOCK180 CED-2 CRKII CD19 PSR CD91 CD14 Beta-5 integrins Beta-3-integrins CED-7 ABC1 CED-6 GULP CED-1 Scavenger receptor Phagocytic cell Apoptotic cell

54 Lapoptose est caractérisée par: Une fragmentation déterminée de lADN M Norm Apop Nec

55 Une fragmentation déterminée de lADN

56 Étude de la Génotoxicité Étude de la Génotoxicité Chapitre 4.

57 Les chromosomes ne sont pas des structures inertes, stables, qui maintiennent l'information génétique dans un stockage statique. Ils subissent continuellement des modifications. Les chromosomes ne sont pas des structures inertes, stables, qui maintiennent l'information génétique dans un stockage statique. Ils subissent continuellement des modifications. Linteraction entre le toxique et l'ADN aboutit généralement : Linteraction entre le toxique et l'ADN aboutit généralement : La génotoxicité : lésions de lADN

58 Les macrolésions: Les macrolésions: Il sagit de lésions qui touchent la totalité du chromosome. Il peut sagir de la perte dun chromosome entier ou de la modification structurale dun chromosome : aberrations chromosomique (aberrations chromosomiques, la formation des micronoyaux).

59 Induction de micro-noyaux

60

61 Fusions centriques Cassures Les aberrations chromosomiques

62 Les microlésions Les microlésions Il sagit de lésions non visibles qui se produisent au niveau des nucléotides. Le changement peut être qualitatif (substitution dune base par une autre) ou quantitatif (perte ou addition dune ou plusieurs paires de bases) On distingue :

63 1. Les adduits Plusieurs xénobiotiques organiques sont capables de se lier de manière covalente avec lADN provoquant une distorsion et une déformation de la molécule dADN qui aboutissent généralement à la cassure de la molécule dADN.

64 Ladduit de lAFB1

65 Sites de fixation sur les G ADN N7: site préférentiel modifié par des alkylants (C2H5, CH3) et les mycotoxines. C8: site préférentiel de fixation des amines aromatiques. N du C2: site préférentiel de fixation d'hydrocarbures aromatiques.

66 2. La désamination Certaines bases peuvent être désaminées spontanément. L'adénine est ainsi transformée en hypoxanthine, la cytosine en uracile et la guanine en xanthine. Les bases modifiées hypoxanthine et uracile n`ont pas les mêmes spécificités d'hybridation que les bases dont elles dérivent.

67 La désamination

68 3. La dépurination

69 Les liaisons Thymine-Thymine sont courtes et entraînent des distorsions dans lhélice de l'ADN. La distorsion de l'hélice de l'ADN entraîne un affaiblissement de l'appariement qui entraîne le blocage de la fourche de réplication. 4. Dimère de Thymine

70 Le Dimère de Thymine

71

72 Il existe un grand nombre d'agents capables de rompre les liaisons phosphodiesters. La réparation normale se fait par l'action de l'ADN ligase. Si une molécule d'ADN comporte un grand nombre de cassures simple-brin; 2 cassures peuvent être localisées chacune sur un brin, cela entraîne la rupture de la double hélice. Les cassures double-brin ne sont généralement pas réparées. 5. Les cassures

73 Noyau non endommagé Noyau légèrement endommagé Noyau endommagéNoyau fortement endommagé

74 Des antibiotiques ou des substances toxiques (nitrites) peuvent entraîner la formation de liaisons covalentes entre une base située sur un brin et une base sur le brin complémentaire. 6. Liaisons croisées

75

76 Certaines de ces modifications sont accidentelles et sont rapidement réparées (les cassures simple brin sont réparées ). Certaines de ces modifications sont accidentelles et sont rapidement réparées (les cassures simple brin sont réparées ). Laltération de l'ADN (adduits ou modifications) n'est pas en elle- même une mutation, mais une lésion prémutationnelle. Une cellule dont l'ADN est endommagé peut répondre de différentes façons : Laltération de l'ADN (adduits ou modifications) n'est pas en elle- même une mutation, mais une lésion prémutationnelle. Une cellule dont l'ADN est endommagé peut répondre de différentes façons : De la lésions de lADN à la Mutation

77 La cellule peut mourir. Si la cellule meurt, les possibilités de mutation sont éliminées La cellule peut mourir. Si la cellule meurt, les possibilités de mutation sont éliminées 2. Elle peut réparer l'ADN de façon correcte et conduire à l'ADN d'origine : Réparation fidèle 3. La cellule possède des mécanismes de réparation qui lui permettent de survivre et de se diviser malgré la présence de lésions de l'ADN, c'est la réparation fautive, infidèle conduisant à des mutations.

78

79

80

81 Bien que les mécanismes de réparation du DNA soient extrêmement efficaces, inévitablement certaines erreurs resteront non corrigées Cela provoquera une modification qui sera perpétuée dans le génome de l'organisme. Ces modifications permanentes transmises par réplication sont appelées des mutations. Substitution Substitution Il sagit de mutations provoquées par remplacement d'une seule base par une base incorrecte. Cette mutation modifiera un seul codon dans le gène affecté. Ceci peut avoir des conséquences graves ou non sur le polypeptide résultant Lésions non réparées Mutations

82

83

84 Insertion et délétion de nucléotide Insertion et délétion de nucléotide mutations par décalage du cadre de lecture mutations par décalage du cadre de lecture Quand une mutation est provoquée par l'insertion ou la délétion d'une base dans un gêne, des dommages génétiques importantes peuvent en résulter. Quand une mutation est provoquée par l'insertion ou la délétion d'une base dans un gêne, des dommages génétiques importantes peuvent en résulter. La conséquence d'une telle mutation est la rupture de la colinéarité normale entre les triplets de lADN et par conséquent celle des codons de lARN messager et donc la séquence en aminoacides de la protéine qui en résulte. La conséquence d'une telle mutation est la rupture de la colinéarité normale entre les triplets de lADN et par conséquent celle des codons de lARN messager et donc la séquence en aminoacides de la protéine qui en résulte.

85 La rupture commencera au site de gain ou de perte d'une base. La rupture commencera au site de gain ou de perte d'une base. Les mutations par décalage montrent souvent prématurément un codon de terminaison qui provoque larrêt de la synthèse protéique et la libération prématurée d'une chaîne polypeptidique incomplète et inactive. Les mutations par décalage montrent souvent prématurément un codon de terminaison qui provoque larrêt de la synthèse protéique et la libération prématurée d'une chaîne polypeptidique incomplète et inactive. Parfois des mutations dites suppressives rétablissent le cadre de lecture normal, il sagit dune seconde mutation. Parfois des mutations dites suppressives rétablissent le cadre de lecture normal, il sagit dune seconde mutation.

86 Lhorloge cellulaire : le Gène P53 en cause Muté dans près de 50% des cancers Muté dans près de 50% des cancers Gardien du génome: Gardien du génome: 2 roles importants 2 roles importants Empêche la division cellulaire en présence danomalies sur lADN, le temps de réparer. Empêche la division cellulaire en présence danomalies sur lADN, le temps de réparer. Si non réparation, enclenche apoptose ou suicide cellulaire Si non réparation, enclenche apoptose ou suicide cellulaire

87


Télécharger ppt "Etude de la Cytotoxicité Etude de la Cytotoxicité Chapitre 2."

Présentations similaires


Annonces Google