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Apoptose Olivier Meilhac Unité INSERM 698 CHU X. Bichat Paris 18 e 01-40-25-86-11.

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1 Apoptose Olivier Meilhac Unité INSERM 698 CHU X. Bichat Paris 18 e

2 1. Introduction Apoptosis - (Gr. "falling") a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R Br. J. Cancer 26:239.

3 Définition – rôle physiologique « mort cellulaire programmée » homéostasie : évite lexcès de cellules éliminer les cellules potentiellement dangereuses celles qui gênent le développement signaux de prolifération incompatibles avec létat cellulaire signaux de mort : perte des signaux de survie (facteurs de croissance, contacts) - récepteur-médiés - non récepteur médiés événements inducteurs :

4 prolifération apoptoseprolifération apoptose Déséquilibre pathologie SIDA Maladies dégénératives anémie aplasique troubles ischémiques (infarctus du myocarde…) maladies du foie induites par toxine (alcool…) Cancer Maladies auto-immunes Infections virales

5 Apoptose vs nécrose

6 Hengartner, M.O Nature. 407:770. Green, D. and Kroemer, G Trends Cell Biol. 8:267. Mitochondrial Pathway Death Receptor Pathway FasL Caspase 3 DD D D Fas/Apo1 /CD95 FADD Procaspase 8 DISC Caspase 8 BID oxidants ceramideothers Bcl-2 D Cytochrome c dATP Procaspase 9 Apaf -1 dATP Apaf -1 Caspase 9 Procaspase 3 apoptosome DNA damage Cellular targets

7 2. Voie extrinsèque Les récepteurs de mort TNF-R1TNF FasFasL DR3Apo3L DR4Apo2L/TRAIL DR5Apo2L/TRAIL CAR 1? DD développement apprentissage du système immunitaire cellules tumorales Elimination des cellules en excès ou dangereuses :

8 TNFR1 TNF DISC caspase 8 active TRADD FasL Pro-caspase 8 Fas FADD DD DED DD DED DD DED DD DED DD DED DD

9 Le lymphocyte T reconnaît un antigène tumoral (CMH) Il augmente lexpression de FasL, mais la cellule tumorale est résistante Lymphocyte T activé exprimant Fas, cest lui qui meurt 2004, 4:321-6 FasL métastase : survie des cellules en milieu immunologique hostile ? Les cellules tumorales contre-attaquent

10 3.Voie intrinsèque radiations ionisantes chimiothérapie dommages mitochondriaux : oxydants, calcium, céramide Elimination des cellules en réponse à une agression modérée : Dec (6): Formation de lapoptosome

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12 activent floppase inhibent translocase

13 Voie extrinsèque voie intrisèque

14 BH4 : anti-apoptotique BH1-3 : pro-apoptotiques BH : Bcl-2 Homology Curr Opin Cell Biol Dec;15(6): Ex : 4. Famille Bcl-2 BH3-only: pro-apoptotiques indirects Activent les pro-apoptotiques Inhibent les anti-apoptotiques Bad –Bik : inactivent Bcl-2 et BclXL Bid- Bim : activent Bax et Bak

15 BIDTruncated BID Caspase 8

16 p53 : pro-apoptotique ou arrêt du cycle cellulaire Lésions de lADN Déficit en facteurs de croissance p53 c-myc + Bax+ p21waf + Fas, DR5+ cycline G + PUMA/NOXA+ gadd45 + APAF1+ mdm2 - Bcl-2… apoptose Arrêt du cycle cellulaire transcription

17 Si accumulation de cellules mutantes par perte de controle apoptotique (ex: bcl-2 augmentée, mutation p53) formation de tumeur

18 Pas de prodomaine Nter (dépourvu dactivité enzymatique) 3, 6, 7 responsables des événements destructeurs caspase cascade 5. Caspases effectrices ou exécutrices

19 Substrats des caspases 65 en 1998 : plus de 280 en 2003 protéines de structure (cytoplasme et noyau) transduction de signal transcription / régulation contrôle du cycle cellulaire réplication / réparation de lADN spécifiques de certains types cellulaires conséquence du clivage souvent inconnu clivage parfois tardif, (accessoire, conséquence de la cascade dactivation) Cell Death and Differentiation, 2003; 10:76-100

20 Substrats en rapport avec les changements morphologiques ICAD : lève linhibition dune DNAse fragmentation de lADN ADN hélicase condensation de la chromatine, remodelage nucléaire gelsoline dépolymérisation de lactine F kinases ROCK-1, PAK2 P° chaine légère de la myosine filaments intermédiaires : cytokératine 18, vimentine organisation des filaments : gas-2, plectine « tenségrité » : liaison cellules-cellules, cellules -matrice extracellulaire Fodrine, FAK, paxilline inh° signaux de survie via intégrines -caténine, E-cadhérine, plakoglobine, desmogléine… Condensation cellulaire, rétraction, détachement protéines du RE, Golgi, vésicules de transport protéines nucléaires lamina, pores (transport perturbé) réparation de lADN : PARP-1… protéines stabilisant la chromatine RNA hélicase A, facteurs de splicing no transcription Facteurs dinitiation de traduction eIF2,3,4… « blebbing »

21 Substrats des caspases et signalisation protéines antiapoptotiques : kinases : Bcl-2, BclX-L : anti proapoptotiques c-FLIP : inhibiteur de la caspase 8 Bid c-Bid : libération de cytochrome c virus : leurres Bcl-2 like Akt et Raf-1 phosphorylent et inactivent Bad NFK-B : fragment de p65 lie lADN mais pas de transactivation IK-B : fragment nest plus dégradé par le protéasome MEKK1 :fragment active dautres caspases

22 6. Méthodes de détection de lapoptose

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24 Changements morphologiques Microscopie photonique : - condensation de lADN, fragmentation nucléaire, corps apoptotiques Microscopie électronique : - balayage - transmission control apoptotic

25 Fragmentation de lADN Chromatin Fragmented Chromatin Agarose gel electrophoresis

26

27 Activation des caspases, changements mitochondriaux substrats chromogènes spécifiques anticorps spécifiques : western blot, immunodétection in situ western-blot cytochrome c : extraits cytosoliques / mitochondriaux cytométrie

28 Exposition des phosphatidyl-sérines Propidium iodide Annexin V-FITC A- control B-spontaneous apoptosis C- actinomycin D D- calcium ionophore Quandrants 1 – viable cells 2 – early apoptosis; PS exposed, intact membrane 3 – late apoptosis; PS exposed, disrupted membrane 4 – necrosis; disrupted & membrane loss

29 Abréviations : TNF: Tumor Necrosis Factor TRADD: TNF Receptor-Associated Death Domain TRAF2 : TNF Receptor-Associated Factor 2 RIP: Receptor-Interacting Protein SODD: Silencer Of Death Domains FADD: Fas-Associated Death Domain DISC: Death Inducing Signaling Complex TRAIL: TNF Related Apoptosis Inducing Ligand DR: Death Receptor IAP : Inhibitor of Apoptosis Protein FLICE : FADD Like Interleukin-1 Converting Enzyme (caspase 8) cFLIP: FLICE Inhibitory Protein APAF: Apoptosis Protease Activating Factor BH: Bcl-2 Homology Bcl-2: B Cell Lymphoma 2

30 7. Anoïkis : apoptose par détachement

31

32 Signaux de survie Protéines liant lactine Collagène, fibronectine, vitronectine RTK actine Akt (ex: TrkB) Signaux anti-apoptotiques : membrane plasmique PI3K INTEGRINES FAKILK Facteurs de croissance Cadhérines -caténine Protéines adaptatrices Cytosquelette Pinch, Nck2, IRS- 1 ? Inhibition de Bad, caspase 9 Transcription dIAP, bcl-2… Inhibition de la transcription de FasL, bim… Cellule 1 Cellule 2

33 Bad FoxO YAP PPP Transcription de gènes pro-apoptotiques Transcription de gènes anti-apoptotiques bcl-2, IAP… FasL, bim… FoxO YAPp73 NOYAU JNK/p38 Caspase 9 iKB-kinaseCREB Bcl-2 séquestrés dans le cytosol AKT - - Dégradation dIKB Translocation de NFKB NFKB mdm2 E3 Ubiquitine-ligase Dégradation de p53 +

34 8. Nouvelles formes dapoptose 8.1 ETosis

35 ElastaseDAPIHistones ElastaseHistones

36

37

38 8.1 Eryptosis

39

40 Anévrisme Changements dégénératifs dans la média Elastine Collagène Protéoglycanes Elastine Collagène Protéoglycanes disparition des CML disparition des CML Anatomique : perte de parallélisme des bords de laorte réalisant une masse battante et expansive Physiopathologique : perte de la fonction de contention de lartère due à une protéolyse progressive de la matrice extracellulaire Définitions thrombus

41 NTT

42 T

43

44 T

45 T

46

47

48 media adventice


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