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Loss-of-Function Mutations of the Rice GAMYB Gene Impair α-amylase Expression in Aleurone and Flower Development Fiorucci Anne-Sophie Simon Marianne Kaneko.

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1 Loss-of-Function Mutations of the Rice GAMYB Gene Impair α-amylase Expression in Aleurone and Flower Development Fiorucci Anne-Sophie Simon Marianne Kaneko et al., janvier 2004

2 Plan de lexposé Introduction 1)Rôle et mode daction de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. 2)Problématique. I- Manipulations et résultats 1)Sélection de mutants OsGAMYB KO. 2)Vérification du rôle de lhomologue OsGAMYB dans linduction de lα- amylase. 3)Phénotypage des mutants. 4)Profil dexpression du gène OsGAMYB. II- Discussion 1)Contradictions avec dautres articles. 2)Critiques Conclusion

3 Introduction : Rôle de lacide gibbérellique (GA) lors de la germination Exemple du caryopse dOrge Albumen Tégument + péricarpe Couche à aleurone Scutellum Embryon AMIDON Glucides simples GA α-amylase

4 Introduction : Mode daction de lacide gibbérellique dans la graine. GA GAMYB Activateur transcriptionnel dans les cellules de la couche à aleurone Induit lexpression de lα-amylase Synthèse dans lembryon Migration jusquà la couche à aleurone GAMYB est un régulateur positif de la voie de signalisation médiée par lacide gibbérellique (cas de lorge)

5 Introduction : Problématique développée Rôle de GAMYB bien connu dans les caryopses dOrge Quelles sont ses fonctions hors de la couche à aleurone ? Objectifs : par lobservation de mutants, étude du rôle de OsGAMYB au cours de la croissance végétative lors du développement floral Protéine étudiée : OsGAMYB, homologue de GAMYB chez le riz

6 Plan de lexposé Introduction 1)Rôle et mode daction de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. 2)Problématique. I- Manipulations et résultats 1)Sélection de mutants OsGAMYB KO. 2)Vérification du rôle de lhomologue OsGAMYB dans linduction de lα- amylase. 3)Phénotypage des mutants. 4)Profil dexpression du gène OsGAMYB. II- Discussion 1)Contradictions avec dautres articles. 2)Critiques Conclusion

7 I-1) Sélection de mutants OsGAMYB KO A noter : le riz ne possède quun seul gène GAMYB criblage par PCR avec des amorces spécifiques du gène et du transposon Méthode utilisation de lignées dont les mutations sont causées par linsertion dun rétrotransposon, Tos17 confirmation de linsertion de Tos17 dans le gène dintérêt et de sa transmission à la descendance

8 Objectif : confirmer que les phénotypes anormaux observés chez le mutant sont dus à linactivation de GAMYB Méthode : introduction du gène OsGAMYB sauvage chez les mutants (utilisation dun vecteur plasmidique) Résultat : les plantules retrouvent le phénotype sauvage. Le phénotype mutant caractérisé est bien causé par linactivation de GAMYB Vérification : Complémentation avec le sauvage

9 I-2) Vérification du rôle de lhomologue OsGAMYB dans linduction de lα-amylase. a- 1ère expérience GA (1µM) Graine sans embryon issue des lignées mutantes gamyb-2 Agarose + amidon La présence damidon est révélée par du lugol. Sil y a production dα-amylase, lamidon sera hydrolysé. Doù lapparition de zones claires sur la boîte.

10 Résultats obtenus : Témoin : graines sauvages zones claires autour de toutes les graines activité α-amylasique normale Graines issues de la lignée mutante seules 75% des graines présentent un halo clair, preuve de la sécrétion d α-amylase les autres sont homozygotes pour lallèle mutant

11 b- 2ème expérience : RNA gel blot analysis [GA]=10 -6 M suffit à induire lexpression de lα-amylase dans les cellules de la couche à aleurone Pas dinduction de lexpression de lα-amylase avec ou sans GA Les allèles contenant linsertion Tos17 ont perdu la fonction OsGAMYB.

12 I- 3) Phénotypage des mutants. a- Au stade végétatif. Aucune différence nest observée. développement post germination identique, plants mutants et sauvages indiscernables. 2 semaines8 semaines après germination une même réponse au GA après la germination. Élongation des feuilles en fonction de la concentration en GA exogène. WT gamyb1

13 b- Lors du développement floral Phase transition (transition du SAM en méristème floral) et passage dun stade à lautre à des époques similaires, en jours courts comme en jours longs. => osGAMYB non essentiel à la phase transition ni au développement du méristème inflorescentiel. Heading time différent. => Contribution partielle à la formation du méristème floral. élongation des entrenoeuds normale mais longueur finale du 1 er entrenoeud inférieure à celle du sauvage. Peut-être la cause du délai de heading time. WT mutant

14 Observation des organes floraux : Phénotype mild, le plus courant : - étamines aux anthères rétrécies, sans pollen (plantes « mâle stériles »). Cause cellulaire de cette stérilité : problème au niveau du tapis staminal, les microspores ne sy attachent pas, se rétrécissent -> les cellules du tapis envahissent toute lanthère. - pas de problème au niveau des autres organes, pistil fertile notamment. carpelle étamine sauvagemutant phénotype mild Coupes longitudinales de fleurs de riz anthère filet WT mutants Étamines de fleurs de riz Certains phénotypes plus sévères (pistil stérile), selon conditions environnementales, et non selon mutant.

15 I- 4) Profil dexpression du gène OsGAMYB. a- couplage avec la protéine Gus. Principe : ADN plasmidique Promoteur de OsGAMYB ORF codant la protéine Gus Transfection dans un cal de riz WT via Agrobacterium tumefaciens. Lactivité β-glucuronidase de GUS peut être détectée in-situ (coloration bleue). But : vérifier que OsGAMYB est exprimé de manière spécifique dans les tissus ou cellules montrant des phénotypes anormaux dans les plants mutants.

16 Observation dans une graine en germination. Couche à aleurone de lendosperme Tégument de lembryon 2mm Coupe longitudinale dune graine de riz, après 24h de réhydratation. recouvre le patron dexpression de lα-amylase.

17 Observation dans la jeune plantule 2mm Tissus vasculaires Couche épithéliale Coupe longitudinale dune plantule de 2 semaines. Aucune expression dans les autres tissus et organes de la plantule.

18 Observation dans un plant au stade végétatif. Racine de riz 1mm Coupe longitudinale dun plant de 2 mois Expression de Gus à lextrémité des racines uniquement. Aucune expression dans les organes aériens au stade végétatif. 2mm

19 Observation dans un plant au stade délongation. SAM Départs de racines adventives Coupe longitudinale dune tige au stade délongation. - Forte expression dans la région apicale dont SAM et primordia foliaires. - Expression modérée dans la zone délongation de lentrenoeud et les départs de racines. 1cm

20 Observation dans les organes floraux. Très forte expression dans les primordia dorganes floraux. Organes précis dans lesquels a lieu lexpression non déterminés. Pour ce faire, utilisation dune autre technique : Lhybridation in situ.

21 b- Hybridation in situ. Principe : Sonde : brin antisens de lextrémité 3-term de lADNc de OsGAMYB, marquée par du digoxigenin-UTP (étiquette fixée par transcription in vitro) Cellule exprimant OsGAMYB ARNm Sondes Organe fixé et déshydraté Témoin avec une sonde brin sens : pas de signal dhybridation, on a bien fixation sur lARNm et non sur un éventuel ADN dénaturé.

22 Confirmation dune donnée de Gus. Primordia de feuilles Méristème apical végétatif dun plant de 2 mois. SAM Primordium de bractée Méristème apical à la transition florale. - Pas dhybridation de la sonde donc dexpression dans la zone apicale au stade végétatif. - Observation dun léger signal dhybridation dans le SAM et les primordia au stade transition florale.

23 Observation dans les organes floraux. Primordium détamine Méristème floral en développement. 0,1mm 25µm Épiderme Endothélium Couche intermédiaire Tapis staminal Cellule mère des microspores Section dune anthère en développement. - Fort signal dans les primordia détamines, modéré dans les primordia des autres organes floraux. - Après différentiation anthère / filament: expression dans les cellules du tapis staminal, jamais dans les cellules mères des microspores. Remarque : résultats en accords avec ceux observés chez lOrge.

24 c- Bilan. Expression de OsGAMYB spécifiquement dans les organes et cellules présentant un phénotype différent du sauvage dans les mutants KO : Dans les cellules exprimant lα-amylase. Dans les entrenoeuds en élongation. Dans les méristèmes apicaux au moment de la transition florale. Dans les étamines et plus précisément dans les cellules du tapis staminal. Donc : Confirmation dun rôle de OsGAMYB dans ces cellules ou organes.

25 Plan de lexposé Introduction 1)Rôle et mode daction de GA durant la germination : un rôle bien caractérisé de GAMYB. 2)Problématique. I- Manipulations et résultats 1)Sélection de mutants OsGAMYB KO. 2)Vérification du rôle de lhomologue OsGAMYB dans linduction de lα- amylase. 3)Phénotypage des mutants. 4)Profil dexpression du gène OsGAMYB. II- Discussion 1)Contradictions avec dautres articles. 2)Critiques Conclusion

26 II-1) contradictions avec des articles précédents. Blàzquez et al (1998): -Timing de la floraison dA thaliana régulé par le gène LEAFY. Blàzquez and Weigel (2000): - Présence dun GAMYB Binding Domain dans les séquences cis de LEAFY, nécessaire à son expression normale. Doù modèle proposé par Gocal et al (2001): GA + GAMYB + LEAFY + Floraison En contradiction avec labsence de rôle dans le timing de la floraison ici observée chez le riz. Une différence entre les deux espèces ou…?

27 II-2) Analyse critique Point positif de larticle : multiplication des démarches pour vérifier que les phénotypes mutants observés sont bien le résultat de linactivation de OsGAMYB. Ce qui manque peut-être : étude quantitative de lexpression de OsGAMYB (Southern Blot) faire un lien entre lexpression du gène OsGAMYB dans les différents organes et le GA réalisation dune autre expérience avec la protéine Gus, avec ajout de GA, et dun Southern Blot avec ajout de GA exogène. Démarche classique de génétique inverse

28 Conclusion : Rôle de OsGAMYB Dautres mutants du riz insensibles au GA présentent des défauts de croissance des feuilles et des racines => rôle de GA. Mais : signalisation du GA indépendante de OsGAMYB au stade végétatif. Rôle significatif de GAMYB, non dans la transition florale, mais plus tard, pour le développement du méristème inflorescentiel.

29 Rôle dans la mise en place des organes floraux : modèle proposé. Rôle essentiel pour la méiose des cellules mères des microspores, donc pour la formation du pollen. Rôle indirect (Cf. profil dexpression), via cellules du tapis staminal. Modèle: Tapis staminal Cellule mère des microspores 1- adhésion 2- contraction du cytoplasme – 1ere division Intervention de GAMYBOsGAMYB KO => Pas de méiose, dégénérescence de la cellule mère. Pas dadhésion Mutants KO pour GA : développement du pollen bloqué avant ou après la méiose de la cellule mère. => On peut supposer une intervention conjointe de GA et OsGAMYB dans ce mécanisme.


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