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11 Technologie de lADN recombinant Gaëlle DIRIBARNE, 2008

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1 11 Technologie de lADN recombinant Gaëlle DIRIBARNE, 2008

2 2 ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Principe Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Exemple : gène associé à une maladie Amplification de cet ADN, expression des protéines correspondantes... Obtention d'un ADN Recombinant

3 3 Définitions Génie Génétique ou technologie de lADN recombinant : ensemble des techniques de construction dun ADN recombinant et ses utilisations. Les cellules modifiées (ayant intégré un ADN recombinant) peuvent exprimer la protéine recombinante (par exemple une protéine dune espèce différente, une protéine modifiée (mutée, fusionnée à une étiquette…)). L'ADN recombinant provient d'une combinaison entre l'ADN d'un organisme donneur et celui dun vecteur (qui peut être d'une espèce totalement différente). Le clonage désigne plusieurs choses : - Une multiplication à l'identique (conservation parfaite de l'information génétique) : à léchelle cellulaire (clonage cellulaire) ou à léchelle de lorganisme entier (clonage reproductif). - Lamplification dun fragment dADN par des micro-organismes après son insertion dans un vecteur

4 4 Plan A/ Les principales techniques du génie génétique B/ La diversité des techniques du génie génétique C/ Les applications de la technologie de lADN recombinant

5 55 A/ Les principales techniques du génie génétique

6 6 Principe de la technologie de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant Expression et purification des protéines correspondantes, étude du niveau dexpression et des fonctions des protéines... I) Obtention de lADN recombinant II) Utilisation de lADN recombinant

7 7 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 1) Origine de lADN de lorganisme donneur 2) Amplification du fragment dADN du donneur 3) Présentation dun vecteur 4) Insertion de lADN dans le vecteur : - Digestion - Ligation 5) Amplification de lADN recombinant obtenu6) Vérification de la construction

8 8 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt 1) Origine de lADN de lorganisme donneur

9 9 L'ADN de l'organisme donneur peut être : - de l'ADN génomique (extrait à partir d'une culture cellulaire...) - de lADN complémentaire (ADNc) obtenu par transcription réverse sur des ARN messagers (LADNc comporte une information sur les régions 5' et 3' non traduites, et ne contient pas d'introns)

10 10 1) Origine de lADN de lorganisme donneur AAAAAA 3 ARNm avec queue polyA 5 => Obtention d'un brin dADN complémentaire Pour obtenir le deuxième brin dADNc, une PCR est réalisée sur lADN obtenu avec une ADN polymérase (voir principe diapo 12). LARN peut être éliminé par un traitement la RNase. On peut obtenir une banque d'ADNc : clonage de tous les ADNc (cela dépend des ARNm exprimés par une cellule à un moment donné dans des conditions données) On peut aussi cloner un ADNc spécifique en choisissant une amorce à cheval sur la queue polyA et le 3' du transcrit Principe de la transcription réverse TTTTT 1) Hybridation avec un oligonucléotide complémentaire de la queue polyA 2) Élongation de l'amorce par la transcriptase réverse

11 11 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt 1) Origine de lADN de lorganisme donneur 2) Amplification du fragment dADN dintérêt

12 12 2) Amplification du fragment dADN d'intérêt : la PCR Amplification du fragment d'ADN d'intérêt (gène entier ou tronqué) par PCR : Polymerase Chain Reaction La PCR est une réaction de polymérisation en chaîne à partir d'amorces spécifiques de l'ADN d'intérêt, grâce à l'action d'une enzyme, lADN polymérase dans un milieu contenant des nucléotides

13 13 2) Amplification du fragment dADN d'intérêt : la PCR Séquence à amplifier 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

14 14 2) Amplification du fragment dADN : la PCR Temps Température (°C) Tm 1ère étape : dénaturation de l'ADN à 95°C (séparation des brins complémentaires) 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5'

15 15 2) Amplification du fragment dADN : la PCR Temps Température (°C) Tm 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' Amorce 2ème étape : hybridation des amorces (séquence de nucléotides complémentaires de lextrêmité de la région à amplifier) à une température Tm (spécifique de l'amorce) (en général amorces de nucléotides) 5 G T C 3' 3' C G C 5'

16 16 Temps Température (°C) Tm 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' 3ème étape : élongation (synthèse du brin complémentaire à partir des amorces grâce à lenzyme ADN polymérase et aux nucléotides présents dans le milieu réactionnel). Fonctionnement de lenzyme à 72°C. G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A 2) Amplification du fragment dADN : la PCR Fin du premier cycle de PCR : aucune molécule obtenue ne correspond au produit désiré (souligné). Un nouveau cycle de PCR (dénaturation-hybridation-élongation) commence.

17 17 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5'G T C G G A A T C C A T G C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'C A G C C T T A G G T A C G C 5' 5'G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 2) Amplification du fragment dADN : la PCR 5'T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' C G C 5' G T C 3'A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' G G A A T C C A T G C G T A C G 3 3'A T A G C A G C C T T A G G T A Produits du 1 er cycle de PCR : Produits du 2 ème cycle de PCR : (les amorces sont en magenta) Brin 1 Brin 2 Brin 3 Brin 4 Produit PCR formé à partir du brin 1 Produit PCR formé à partir du brin 2 Produit PCR formé à partir du brin 3 Produit PCR formé à partir du brin 4

18 18 Temps Température (°C) Tm 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' G T C G G A A T C C A T G C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C 5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' C A G C C T T A G G T A C G C 5' G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' 1er cycle2ème cycle Molécules obtenues à la fin du second cycle de PCR. Aucune ne représente le produit d'intérêt (souligné). 2) Amplification du fragment dADN : la PCR

19 19 T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' Fin du troisième cycle : deux produits PCR attendus apparaissent. Ces produits vont ensuite se multiplier de façon exponentielle par rapport aux produits non souhaités. 2) Amplification du fragment dADN : la PCR Molécules dADN obtenues à la fin du 3 ème cycle de PCR :

20 20 T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G C A G C C T T A G G T A C G C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 2) Amplification du fragment dADN : la PCR Quatrième cycle de PCR : 8 fragments d'ADN d'intérêt Cinquième cycle de PCR : 22 fragments d'intérêt Les deux molécules dintérêt obtenues au 3 ème cycle donnent chacune deux molécules dADN dintérêt au 4 ème cycle. 4 fragments simple brin des autres molécules pourront donner un produit PCR souhaité au 4 ème cycle.

21 21 Répétition des 3 étapes : dénaturation-hybridation- élongation (la machine à PCR fait des cycles de température) => Amplification du fragment d'intérêt de façon exponentielle à partir du troisième cycle Lenzyme ADN polymérase ne doit pas être dénaturée à 95°C : utilisation de l'ADN polymérase de bactéries thermophiles (par exemple la Taq polymérase provient de Thermophilus aquaticus, microorganisme vivant près des sources deaux chaudes (50 à 80°C) ; la Pfu polymérase provient de Pyrococcus furiosus) Différentes enzymes peuvent être utilisées selon le degré de fidélité souhaité pour l'amplification du fragment (la Pfu est beaucoup plus fidèle mais plus lente pour l'amplification par exemple) 2) Amplification du fragment dADN : la PCR

22 22 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) 3) Présentation dun vecteur Le clonage repose sur l'insertion d'un fragment d'ADN exogène dans un vecteur, ce qui permet ensuite d'exprimer l'ADN dans des cellules

23 23 3) Présentation dun vecteur de clonage Grande diversité des vecteurs : (détaillée en B) Cosmides Bactériophages Chromosomes artificiels de levure (YAC) et de bactérie (BAC) Plasmides : très souvent utilisés, réplication dans les bactéries (exemple choisi) Les vecteurs utilisés en génie génétique ont souvent une origine naturelle (plasmides, bactériophages) mais ont été largement modifiés

24 24 3) Présentation dun vecteur : Propriétés du vecteur Capacité de réplication autonome dans une cellule hôte donnée Possession dun site de clonage multiple pour l'insertion du fragment d'ADN (correspond à différents sites uniques de restriction = des sites où le vecteur peut être ouvert, voir 4)) Insertion d'un fragment d'ADN plus ou moins grand bien supportée Présence fréquente dun marqueur de sélection (gène de résistance à un antibiotique, marqueur de sélection métabolique)

25 25 3) Présentation dun vecteur : Exemple du plasmide a) Vecteur Site de clonage multiple : nombreux sites de restriction (voir 4)) uniques permettant l'insertion de l'ADN après le promoteur Origine de réplication dans la bactérie Marqueur de sélection : résistance contre l'antibiotique kanamycine Plasmide : petite molécule extrachromosomique, d'ADN double brin circulaire, de 3 à 10 kilobases. Capable de se répliquer indépendamment du chromosome bactérien et pouvant être transféré d'une cellule à une autre. Promoteur (pour pouvoir exprimer la protéine d'intérêt il faut cloner la séquence d'ADN en phase avec le promoteur (cf. cadre de lecture de la traduction)

26 26 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur 4) Insertion de lADN dans le vecteur :

27 27 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Définition des enzymes de restriction Une enzyme de restriction est une protéine capable de couper un fragment d'ADN au niveau d'une séquence de nucléotides caractéristique appelée site de restriction. C'est une endonucléase (coupure à l'intérieur du brin d'ADN au niveau des liaisons phosphoesters). Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, dont un grand nombre se retrouve naturellement chez la bactérie. En effet, les enzymes de restriction peuvent couper (et ainsi conduire à la destruction) de l'ADN étranger (notamment des virus). Cela limite les infections virales chez les bactéries, d'où le terme de restriction. L'ADN bactérien lui-même est protégé de la coupure par des modifications du type méthylation.

28 28 GAATTC CTTAAG Exemple : site de restriction de l'enzyme EcoRI (provenant de la bactérie Escherichia coli) 5' 3' 5' G AATTC CTTAA G 5' 3' 5' 3' Coupure par EcoRI Rq : Certains sites de restriction sont des séquences palindromiques 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Exemple dune enzyme de restriction Formation d'extrémités dites cohésives, ou bouts collants Rq : Certaines enzymes donnent des bouts francs après coupure. Exemple : SmaI : CCC GGG GGG CCC

29 29 Vecteur (plasmide) Vecteur digéré + Petit fragment dADN dégagé lors de louverture du plasmide 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Principe Site de restriction Enzyme1 Site de restriction Enzyme 2 Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Digestion 1 heure dans le tampon adapté à l'enzyme (cf. quantité de sels...) à la température optimale de l'enzyme Si lon digère le fragment dADN par les deux mêmes enzymes 1 et 2, donnant des bouts collants, on obtient des extrémités cohésives complémentaires avec celles du vecteur. Ceci permet linsertion du fragment dADN dans le vecteur. TTAA AATT TTAA AATT Vecteur Fragment à cloner

30 30 5' ADN d'intérêt 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Digestion du fragment dADN Le fragment dADN dintérêt ne contient pas forcément les bons sites de restriction. Comment peut-on les ajouter aux extrêmités de lADN à cloner ? Cela se fait par PCR avec des amorces spéciales : 5' T A T C G T C G G A A T C C A T G C G T A C G 3' 3' C G C G T C 3' 3' A T A G C A G C C T T A G G T A C G C A T G C 5' 5' Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 1 Amorce avec une partie s'hybridant sur l'ADN à amplifier et une partie qui ne s'hybride pas comportant la séquence d'un site de restriction 2

31 31 G T C G G A A T C C A T G C G C A G C C T T A G G T A C G C ADN d'intérêt 5' 3' Voici l'ADN obtenu après PCR, avec les sites de restriction à ses extrémités. Il pourra être utilisé pour le clonage. Séquence du site de restriction de l'enzyme 1 Séquence du site de restriction de l'enzyme 2 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Digestion du fragment dADN

32 32 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Digestion du vecteur Vecteur (plasmide) Vecteur digéré + Petit fragment dADN dégagé lors de louverture du plasmide Site de restriction Enzyme1 Site de restriction Enzyme 2 Digestion par les enzymes 1 et 2 Création de 2 extrêmités cohésives (ou franches) 1 et 2. Le fragment dADN doit être cloné dans le vecteur digéré. Le petit fragment dégagé peut se réinsérer dans le vecteur digéré à la place du fragment dADN à cloner. Il est donc nécessaire de séparer les deux produits de la digestion du vecteur et de purifier le vecteur digéré pour la suite du clonage.

33 33 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré Lélectrophorèse est une méthode de séparation des particules chargées électriquement par migration différentielle sous laction dun champ électrique. Elle sapplique aux : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques, nucléotides La migration dépend de la charge et de la géométrie des particules Lélectrophorèse peut se faire en veine liquide ou sur un support homogène, poreux et relativement inerte (papier, gels…)

34 34 Solution d'électrolyte qui recouvre le gel (assure la conduction électrique) Gel d'agarose Les fragments de restriction sont visualisés sur gel d'agarose par électrophorèse : ci-contre le dispositif utilisé Dépôt des échantillons dans les puits du gel + Générateur électrique - 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel dagarose champ électrique Principe : migration des fragments d'ADN dans un champ électrique, séparation en fontion de leur taille

35 35 Fragments de restriction : vecteur digéré et bout dégagé par la restriction Dépôt dans le puits du gel - + Particule de gel Migration des fragments d'ADN entre les particules de gel selon le gradient électrique (les acides nucléiques sont globalement négatifs, déplacement vers le pôle +) Les fragments d'ADN migrent de façon inversement proportionnelle à leur taille : les plus gros fragments migrent peu tandis que les petits fragments migrent beaucoup 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel dagarose Principe de lélectrophorèse :

36 36 Révélation du gel par incubation avec un intercalant d'ADN (fluorescent) 1 1 : bande du vecteur digéré 2 : petit fragment extrait du vecteur lors de la digestion 2 Il est possible de récupérer la bande 1 : on découpe la bande sur le gel, on extrait l'ADN de l'agarose et on le purifie sur une colonne (fixation de l'ADN sur la colonne, lavage, puis élution de l'ADN purifié) => on récupère ainsi l'ADN du vecteur digéré, utilisé pour le clonage. Cette purification sur gel permet aussi déliminer en partie les traces de vecteur non digéré. Si le fragment dADN dégagé à éliminer est très petit, une purification sur colonne peut être suffisante. Marqueur de poids moléculaire : fragments de taille connue (obtenus par exemple après digestion enzymatique de l'ADN du bactériophage Lambda) => cela permet de déterminer la taille des bandes d'intérêt par comparaison au marqueur 4) Insertion de lADN dans le vecteur a) Digestion du fragment dADN et du vecteur : Purification du vecteur digéré : Electrophorèse sur gel dagarose

37 37 5' 3' 5' 3' Fragment dADN à cloner 5' 3' 5' 3' => Création d'extrémités collantes complémentaires. Insertion du fragment dADN dans le vecteur ouvert purifié, hybridation au niveau des extrêmités complémentaires. Il reste à lier ces deux morceaux dADN de façon covalente. 4) Insertion de lADN dans le vecteur b) Ligation du fragment dADN dans le vecteur Vecteur (plasmide) Vecteur digéré + Petit fragment dADN dégagé lors de louverture du plasmide Site de restriction Enzyme1 Site de restriction Enzyme 2 Digestion du vecteur et du fragment dADN à cloner par les enzymes 1 et 2

38 38 La ligase est une enzyme capable de former des liaisons covalentes (formation de liaisons phosphoester) entre deux molécules d'ADN (au niveau d'une zone d'hybridation des molécules d'ADN) Fragment d'ADN dintérêt inséré dans le vecteur 5' P 3' 0H P 5' OH 3' -P P- Ligase Liaison phosphoester Après ligation, on obtient un plasmide recombiné 4) Insertion de lADN dans le vecteur b) Ligation du fragment dADN dans le vecteur Intérêt d'utiliser deux enzymes différentes lors de la digestion : insertion orientée de lADN à cloner dans le vecteur limitation de la religation du vecteur sur lui-même

39 39 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu

40 40 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Transformation des bactéries 1) Mélange de plasmides et de bactéries compétentes sur glace (les bactéries compétentes ont été traitées pour faciliter l'entrée d'ADN : leur paroi a été fragilisée par un traitement au chlorure de calcium) (utilisation de Escherichia coli en général : utilisation facile, croissance rapide) 2) Choc thermique à 42°C : les plasmides vont pénétrer dans les bactéries 4) Étalement sur boîte (pour la sélection) 3) Ajout de milieu nutritif aux bactéries, croissance 1h à 37°C (cela permet l'expression des protéines de résistance aux antibiotiques pour la sélection ultérieure)

41 41 Mélange de bactéries transformées contenant le plasmide d'intérêt et de bactéries non transformées Étalement des bactéries sur une boîte contenant un milieu gélosé et un antibiotique : seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l'antibiotique Colonie de bactéries transformées Il faut sélectionner les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné) 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Sélection des bactéries transformées

42 42 Ensemencement dune colonie de bactéries transformées dans du milieu liquide + antibiotique une nuit à 37°C => Multiplication des bactéries et donc amplification du nombre de plasmides recombinés (cf. présence d'une origine de réplication bactérienne sur le plasmide, l'antibiotique assure une pression de sélection pour que les bactéries conservent le plasmide) Il faut ensuite récupérer le plasmide 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné

43 43 Les bactéries sont lysées par un détergent en milieu alcalin afin de libérer l'ADN génomique et plasmidique. L'ADN génomique et les protéines sont précipités par de l'acétate de sodium. Le précipité est séparé par centrifugation, le surnageant contient l'ADN plasmidique. L'ADN plasmidique est alors précipité (volume double d'éthanol ou isopropanol), lavé puis redissous dans un tampon adéquat. Cette étape peut être réalisée avec des colonnes de purification dADN. 5 ) Amplification de lADN recombinant obtenu : Extraction du plasmide recombiné

44 44 I) Obtention de lADN recombinant ORGANISME DONNEUR : Extraction d'un fragment d'ADN d'intérêt VECTEUR (fragment d'ADN capable de réplication autonome) Insertion du fragment d'intérêt dans le vecteur Obtention d'un ADN Recombinant amplifié 6 ) Vérification de la construction Les bactéries poussant sur le milieu+antibiotique possèdent un plasmide avec le gène de résistance à lantibiotique. Mais ce plasmide contient-il linsert cloné ? Il peut y avoir religation du vecteur sur lui- même. Nécessité dun crible pour trouver les clones positifs ayant intégré lADN à cloner.

45 45 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui- même (2) => il faut distinguer ces deux populations PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose 1 2

46 46 Les bactéries transformées peuvent contenir le plasmide recombiné (contenant l'ADN qui nous intéresse) (1) ou le vecteur refermé sur lui- même (2) => il faut distinguer ces deux populations PCR avec les amorces ayant servi à l'obtention de l'insert, observation des produits formés sur gel d'agarose : Résultats du gel dagarose : (1)(2) Aucun produit détecté pour le vecteur seul (2), mais un produit visible pour le plasmide recombiné (1) 6 ) Vérification de la construction a) Vérification rapide par PCR

47 47 Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur : (ex : MscI) ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

48 48 (1)(2) 1)Digestion enzymatique par une enzyme avec un site présent dans l'insert et un seul site dans le vecteur puis 2)Analyse des produits de restriction sur gel d'agarose On obtient des cartes de restriction différentes : une seule coupure et donc une seule bande pour le vecteur seul (2), deux coupures et donc deux bandes pour le plasmide recombiné (1) 6 ) Vérification de la construction b) Vérification rapide par restriction

49 49 ADN de séquence connue ADN de séquence inconnue, à séquencer 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger Didésoxyribose : formation d'une liaison phosphoester impossible, blocage de l'élongation de la chaîne synthétisée P nucléotide Et de nucléotides didésoxyribose. 5-P-polynucléotide Choix d'une amorce Synthèse du brin complémentaire par une ADN polymérase La synthèse du brin complémentaire est faite en présence de nucléotides désoxyribose, Désoxyribose : formation possible d'une liaison phosphoester (élongation de la chaîne synthétisée) P nucléotide 5-P-polynucléotide

50 50 Réaction de synthèse du brin complémentaire de l'ADN à séquencer à partir d'une amorce, et en présence de nucléotides et d'un didésoxynucléotide => formation de fragments de différentes tailles, dont la synthèse est bloquée au niveau du didésoxynucléotide intégré : A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A amorce ADN à séquencer 5' 3' ddT T-A-ddT T-A-T-C-G-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 5' Brins formés en présence de didésoxy- thymine (ddT) dans le milieu réactionnel 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

51 51 Les didésoxynucléotides sont marqués : radioactivité ou fluorescence. Analyse des différents brins formés sur gel ultra-résolutif (détection d'une différence d'un nucléotide) ddT 1 T-A-ddT 2 T-A-T-C-G-ddT 3 T-A-T-C-G-T-A-A-ddT 4 T-A-T-C-G-T-A-A-T-ddT 5 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-ddT 6 5' 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

52 52 T-A-T-C-G-T-A-A-T-T-C-G-C-T A-T-A-G-C-A-T-T-A-A-G-C-G-A ddTddAddGddC ADN à séquencer : Lecture du brin complémentaire : Une réaction de synthèse différente pour chacun des didésoxynucléotides, analyse sur gel pour chaque réaction, lecture du brin complémentaire (en partant des plus petits fragments vers les plus gros) ' 5' 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Principe de la méthode de Sanger

53 53 ADN à séquencer : Lecture du brin complémentaire : 5'G-T-C-T-T-A-A-C-G-T-C-T-C-A 3'C-A-G-A-A-T-T-G-C-A-G-A-G-T Automatisation des résultats de séquençage : les didésoxynucléotides sont marqués avec des fluorescences différentes, cela permet de faire une seule réaction et une seule lecture. Le séquenceur détecte la fluorescence et repère la taille des fragments d'ADN. On obtient des courbes de fluorescences qui sont interprétées en terme de nucléotides avec un indice de confiance (ici barre verte : confiance maximum) 6 ) Vérification de la construction c) Vérification par séquençage : Automatisation du séquençage

54 54 II) Utilisation de lADN recombinant Obtention d'un ADN Recombinant amplifié Utilisation de lADN recombinant, notamment pour comprendre le fonctionnement des gènes Quelques exemples : - Production et purification de la protéine étudiée en grandes quantités (pour des analyses structurales, recherche de protéines associées, de modifications post- traductionnelles…) - Etude de lexpression des gènes, quantitative et qualitative ; temporellement et spatialement - Etude de la fonction des gènes (fabrication de protéines mutantes…) 1) Production de protéines recombinantes

55 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions 55 Expression des protéines dans des bactéries E. coli dépourvues de protéases (préservation de la protéine produite) Les cellules sont cultivées en grandes quantités (dans des fermenteurs pour la production de protéines à l'échelle industrielle) Problème : avec un fort taux de croissance et une synthèse très importante des protéines recombinantes, les cellules meurent rapidement, ce qui limite alors l'expression des protéines recombinantes Pour résoudre ce problème : découplage entre une phase de croissance (multiplication des bactéries, et donc amplification du gène de la protéine d'intérêt) et une phase d'expression (transcription du gène qui conduira à la synthèse de la protéine)

56 56 Une cellule hôte procaryote présente certaines contraintes : nécessité d'un promoteur procaryote pour que la bactérie puisse transcrire le gène d'intérêt (il faut donc travailler avec un vecteur adéquat) la bactérie ne fait pas d'épissage. Ce problème est évité par une construction à partir d'un ADNc (comme il est obtenu à partir d'un ARNm mature, il est dépourvu d'introns) Cependant, culture facile et croissance rapide des bactéries (contrairement aux cellules eucaryotes comme levures et ovules) 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole : contraintes et solutions

57 57 1) Culture des bactéries dans du milieu nutritif + antibiotique nécessaire à la sélection => à 37°C, jusqu'à une densité optique de 0,6 environ (cela correspond à la phase exponentielle, les bactéries sont en pleine croissance) 0) Transformation de bactéries compétentes par le plasmide d'intérêt, culture à partir des colonies obtenues 2) Induction de l'expression des protéines par activation de la trancription du gène de la protéine 3) Récupération des protéines 1) Production de protéines recombinantes a) Protocole

58 58 La transcription du gène codant pour la protéine dintérêt est contrôlée à laide de promoteurs inductibles : Promoteurs thermosensibles (changement de lexpression suivant la température) Promoteur de lopéron lactose 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel

59 59 Présentation de lopéron lactose : P LacI T CAP P O LacZ T LacYLacA P : promoteur T : terminateur O : opérateur CAP : site de fixation de CAP (récepteur de l'AMPcyclique), activateur de la transcription Répresseur de l'opéron lactose : en se fixant sur lopérateur, il bloque la transcription de LacZ, LacY et LacA Bétagalactosidase (clivage du lactose en glucose + galactose) Perméase (pompage du lactose dans la cellule) Transacétylase 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel Gène régulateur Gènes de structureSites de contrôle

60 4) Lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Transcription basale P LacI T CAP P O Gènes de structure 3) Lactose, peu de glucose dans le milieu : => Transcription active LacI P T CAP P O Gènes de structure Analogue de lactose CAP Polymérase Fonctionnement de l'opéron lactose dans la bactérie : 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel 1) Absence de lactose, beaucoup de glucose dans le milieu : => Absence de transcription P LacI T CAP P O Gènes de structure LacI 2) Absence de lactose, peu de glucose dans le milieu : => Absence de transcription P LacI T CAP P O Gènes de structure LacI CAP 60

61 61 Pour les clonages,remplacement du gène LacZ par la séquence du gène de la protéine d'intérêt. Utilisation d'IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), un analogue de lactose : l'IPTG se lie avec le répresseur, l'empêchant alors de se fixer sur l'opérateur. Cela permet l'activation de la transcription P LacI T CAP PO Gène de la protéine d'intérêt T Modification de l'opéron lactose pour les clonages : 1) Production de protéines recombinantes b) Contrôle transcriptionnel LacI IPTG Transcription active

62 Les protéines sont dans le cytoplasme des bactéries, qui ont aussi une paroi. Il est donc nécessaire de lyser les bactéries pour récupérer les protéines. Etape de sonication (destruction mécanique par des ultrasons) et ajout dun détergent (lyse chimique) 62 1) Production de protéines recombinantes c) Extraction des protéines

63 Prélèvement dun échantillon de lextrait bactérien, supposé contenir nos protéines Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant Le gel de polyacrylamide est une matrice inerte formant beaucoup de liaisons croisées à travers lesquelles migrent les protéines. Il joue le rôle d'un tamis moléculaire. La taille des pores peut être ajustée suivant la taille des protéines que l'on souhaite visualiser. 63 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

64 Prélèvement dun échantillon de lextrait bactérien, supposé contenir nos protéines Dénaturation des protéines par mélange avec du tampon de charge, et chauffage 5min à 95°C Le tampon de charge (Laemmli) contient notamment : - du glycérol qui augmente la densité de léchantillon et facilite son dépôt dans les puits du gel - un colorant, qui facilite le suivi de la migration des échantillons sur gel ET SURTOUT : - des agents réducteurs : destruction des ponts disulfures des protéines, - un détergent anionique SDS (sodium dodécylsulfate) : fixation sur les régions hydrophobes de la protéine, cela provoque alors son dépliement => la protéine est soluble dans la solution de détergent Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant 64 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

65 La charge intrinsèque de la protéine est masquée par les charges négatives du SDS. Les protéines vont donc migrer vers le pôle positif lors de l'application d'une tension. Les grandes protéines, quoi que plus chargées négativement migrent moins loin car elles sont davantage retenues par le maillage du gel. Les protéines sont alors fractionnées selon leur masse moléculaire. Rq : Cette méthode est très puissante : elle permet d'analyser des protéines insolubles dans l'eau, protéines membranaires, protéines de gros agrégats... Elle apporte des informations sur la composition des sous-unités d'un complexe protéique. Prélèvement dun échantillon de lextrait bactérien, supposé contenir nos protéines Dénaturation des protéines Electrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturant 65 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

66 + Générateur électrique Solution d'électrolyte Gel dacrylamide dénaturant Dépôt des échantillons dans les puits du gel - Migration des protéines selon leur taille Plus lourd Plus léger Electrophorèse en conditions dénaturantes (destruction des structures tertiaires et quaternaires), migration des protéines inversement proportionnelle à leur masse 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS

67 Toutes les protéines fortement exprimées peuvent être détectées par leur coloration dans le gel (au bleu de Coomassie ou avec du nitrate d'argent pour des protéines moins concentrées). Cest une détection globale de toutes les protéines fortement exprimées. Des protéines en plus faibles quantités peuvent être détectées par Western Blot après transfert sur membrane (ex : membrane de nitrocellulose). Cette détection est spécifique. 67 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Coloration ou transfert sur membrane

68 Les protéines se déplacent selon le champ électrique, elles passent du gel à la membrane. Le transfert se déroule pendant une à 2 heures. Le même principe est utilisé pour le transfert des acides nucléiques (qui peuvent aussi être transférés en une nuit par capillarité, en absence de champ électrique) Gel Membrane - + Générateur électrique 68 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Transfert sur membrane Principe du transfert sur membrane : Papiers buvard imbibés de tampon

69 Détection des protéines sur la membrane par WESTERN BLOT : reconnaissance spécifique de la protéine qui nous intéresse à l'aide d'un anticorps dirigé contre cette protéine. 1) Saturation des sites non spécifiques par incubation avec du lait (les protéines du lait vont se fixer sur la membrane, ce qui limite la liaison des anticorps sur des sites non spécifiques) Membrane Protéine d'intérêt 69 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Détection des protéines par Western blot 2) Incubation avec l'anticorps primaire spécifique de la protéine : Reconnaissance de la protéine par l'anticorps Anticorps primaire spécifique de la protéine

70 3) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés) Membrane Protéine d'intérêt Anticorps primaire spécifique de la protéine 4) Incubation avec l'anticorps secondaire, qui reconnaît l'anticorps primaire. Une enzyme est fixée sur l'anticorps secondaire Anticorps secondaire spécifique du premier anticorps Enzyme fixée sur l'anticorps 70 1) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Détection des protéines par Western blot

71 5) Lavages de la membrane (les anticorps non fixés sont éliminés) Membrane Protéine d'intérêt Exemple d'image obtenue sur film photosensible Signal de notre protéine La lumière émise peut être détectée sur un film photosensible, ou par une caméra Marqueur de poids moléculaire (kDa) ) Production de protéines recombinantes d) Vérification de lexpression des protéines : Détection des protéines par Western blot 6) Révélation du Western Blot : le substrat de l'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique transforme ce substrat en un produit luminescent Substrat de l'enzyme La réaction enzymatique donne un produit luminescent

72 Les électrophorèses sur gel d'acrylamide sont aussi utilisées pour la séparation des acides nucléiques de petite taille ; pour des fragments plus grands, un gel dagarose est utilisé. La révélation se fait après transfert sur membrane : Pour les ADN : on révèle les ADN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de SOUTHERN BLOT. Le Southern Blot a été inventé par Edward M. Southern en Cette méthode a ensuite été appliquée à d'autres molécules que les ADN (Western Blot pour les protéines et Northern Blot pour les ARN) Pour les ARN : on révèle les ARN sur la membrane à l'aide de sondes ADN complémentaires de la séquence de l'ARN étudié, marquées radioactivement (ou chimiquement). On parle de NORTHERN BLOT. 72 1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques

73 Remarque : Comment marquer une molécule dADN pour obtenir une sonde ? 73 1) Production de protéines recombinantes e) Détection des acides nucléiques Fragment dADN de restriction purifié Dénaturation et hybridation avec un mélange doligonucléotides de 6 nucléotides PCR avec ADN polymérase en présence de nucléotides marqués : soit radioativement, soit chimiquement (détection avec un anticorps spécifique du groupement chimique) Obtention de petits ADN marqués, complémentaires de différentes zones sur les 2 brins de lADN considéré

74 74 II) Utilisation de lADN recombinant Les protéines recombinantes sont exprimées en grandes quantités, mais sont mélangées avec les protéines bactériennes. Il est donc nécessaire de purifier la protéine dintérêt. 2) Purification des protéines

75 75 Une technique de séparation des protéines est la chromatographie. Elle nécessite une phase stationnaire et une phase mobile, la séparation se fait en fonction de laffinité des protéines pour chacune des phases. Exemple dune chromatographie sur colonne : Phase stationnaire 2) Purification des protéines a) Chromatographie 1) Solutés (mélange) 2) Passage continu dune phase mobile (solvant) 3) Séparation des composants de léchantillon suivant leur affinité pour la phase mobile et la phase stationnaire

76 - Chromatographie de partage (en phase inverse) : phase stationnaire apolaire et phase mobile polaire. Séparation selon le degré de polarité des composés. - Chromatographie déchange dions : phase stationnaire chargée positivement ou négativement. Séparation suivant la charge des composés. - Chromatographie dexclusion : support poreux. Séparation en fonction de la taille : les grosses molécules sortent très vite de la colonne tandis que les plus petites, qui peuvent traverser les pores sont retardées et sortent plus tard. - Chromatographie daffinité : séparation selon des propriétés de forme. Cest la technique la plus puissante car elle repose sur des interactions spécifiques. 2) Purification des protéines a) Chromatographie Flux de solvant Molécules chargées négativement retenues sur les billes chargées positivement Flux de solvant Petites molécules retardées par la traversée des billes poreuses ; grosses molécules non retardées 76

77 Cette technique est spécifique de la protéine étudiée. Des anticorps reconnaissant la protéine sont fixés à des billes (phase stationnaire). billes anticorps Dépôt de lextrait cellulaire sur la colonne (phase daccrochage sur les anticorps) 77 Protéine dintérêt Chromatographie daffinité : - Immunopurification : utilisation de linteraction Anticorps/Ligand 2) Purification des protéines b) Chromatographie daffinité Après lavages (élimination des molécules interagissant de façon peu spécifique), les protéines dintérêt peuvent être éluées (par exemple avec un peptide compétiteur).

78 Limmunopurification permet de purifier une protéine spécifique, mais il faut disposer dun anticorps suffisamment efficace et spécifique. De plus, on na pas toujours de systèmes délution efficaces. 78 Etiquette (molécule de fusion, par exemple peptide de fusion) Protéine d'intérêt Protéine d'intérêt fusionnée à une étiquette On utilise aussi dautres systèmes de chromatographie daffinité reposant sur des interactions ligand/récepteur du ligand et lutilisation dune protéine recombinante fusionnée à une étiquette. 2) Purification des protéines b) Chromatographie daffinité

79 Protéine d'intérêt avec une étiquette Protéine d'intérêt Protéines bactériennes Peptide de fusion Des groupements (récepteurs du ligand) fixés sur la colonne interagissent avec le peptide de fusion. Toutes les autres protéines, non retenues sur la colonne sont éliminées. Dépôt de l'extrait cellulaire sur la colonne Rétention de la protéine d'intérêt Protéines non retenues sur la colonne Lavages pour éliminer les éventuels contaminants 79 2) Purification des protéines b) Chromatographie daffinité

80 Ajout d'un agent permettant l'élution (un compétiteur) Protéines d'intérêt éluées Après élution on obtient les protéines d'intérêt fusionnées. Un clivage peut être effectué entre la protéine d'intérêt et le peptide de fusion. Un nouveau passage sur colonne d'affinité permet de retenir les peptides de fusion et de récupérer les protéines purifiées Clivage spécifique Rétention de la protéine de fusion sur la colonne Protéine d'intérêt purifiée 80 2) Purification des protéines b) Chromatographie daffinité

81 Conclusion : Utilisation des protéines recombinantes : - Avec de grandes quantités de protéine purifiée, possibilité danalyser la structure 3D par diffraction des rayons X ; possibilité danalyser les modifications post-traductionnelles de la protéine au spectromètre de masse - Possibilité de co-purifier des protéines associées à la protéine étudiée si les lavages ne sont pas trop stringents La protéine est digérée pour obtenir un ensemble de peptides. Dans le spectromètre de masse, les peptides sont fragmentés, et la masse des fragments obtenus est mesurée. Lensemble des masses des différents fragments est caractéristique dune molécule donnée. Cette technique permet didentifier des molécules, mais aussi de détecter des modifications sur une protéine connue Billes Anticorps Protéine dintérêt Protéines associées Séparation des protéines sur gel ; études par Western blot pour des protéines connues ou par spectromètre de masse pour des molécules inconnues 81

82 82 II) Utilisation de lADN recombinant Différents types cellulaires sont caractérisés par lexpression de protéines différentes. Lexpression différente des gènes (codant notamment pour des protéines homéotiques) dans un embryon joue un rôle clé dans la mise en place du plan dorganisation de lorganisme. Suivant les conditions, les besoins en différentes protéines changent (exemple du stress). Comment étudier lexpression des gènes, à la fois dun point de vue quantitatif et qualitatif, et dun point de vue spatial et temporel ? 3) Etude de lexpression des gènes

83 - Par Western blot : pas de quantification absolue. On peut obtenir des données comparatives qualitatives entre différentes conditions. Un gène de ménage est souvent utilisé comme référence. - Par dosage : méthodes spectroscopiques, immunologiques, enzymatiques - Indirectement par Northern blot : information sur la quantité dARN messager correspondant à la protéine (Rq : une augmentation des ARNm peut provenir d'une augmentation de la transcription ou d'une augmentation de la stabilité des ARNm). Le Northern blot fournit des informations plus quantitatives quun Western blot (moins de problème de saturation du signal) 83 3) Etude de lexpression des gènes a) Quantification des protéines dans un extrait cellulaire

84 Le niveau dexpression dun gène peut être quantifié à laide de gènes rapporteurs : remplacement de la portion codante du gène considéré par un gène rapporteur : - gène d'une enzyme (mesure enzymatique) - gène d'une protéine fluorescente (mesure de la fluorescence) Exemple : Remplacement de la séquence codante du gène étudié par la séquence codante dune enzyme : la luciférase. Mesure de l'activité enzymatique in vitro avec ajout du substrat. Ce sont des données relatives, qui doivent être comparées à une référence. 3) Etude de lexpression des gènes : b) Les gènes rapporteurs luciférine (substrat de l'enzyme) Séquences promotrices Séquence codante du gène dintérêt Séquence de la luciférase Luciférase Réaction enzymatique => Emission d'un photon (quantification possible par spectrophotométrie) 84

85 85 3) Etude de lexpression des gènes : b) Les gènes rapporteurs On obtient des informations sur le niveau dexpression dun gène dans une cellule à un moment donné, pour des conditions données (résultats quantitatifs contrairement au Western blot) Activité luciférase 1 2 Gène X quatre fois plus exprimé dans la condition 1 que dans la condition 2 Exemple : niveau dexpression dun gène X sous deux conditions différentes (1et 2)

86 86 3) Etude de lexpression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Ce genre de construction permet également danalyser ce qui contrôle lexpression des protéines : Exemple : Séquence codante du gène X Séquence codante du gène rapporteur 12 A B C D Cellules Séquences promotrices La séquence régulatrice 1 active lexpression du gène X dans la cellule A, la séquence 2 active lexpression de X dans la cellule C

87 87 3) Etude de lexpression des gènes : b) Les gènes rapporteurs Il est possible dobtenir des animaux transgéniques exprimant les séquences promotrices dun gène étudié fusionné à un gène rapporteur. La révélation du produit du gène rapporteur sur des embryons à différents stades apporte des informations spatiales et temporelles sur lexpression du gène étudié. Stade 1 : pas dexpression du gène Stade 2 : expression postérieure du gène Exemple :

88 Comment localiser notre protéine dans des cellules ? Deux possibilités : 1) Regarder la protéine endogène par immunofluorescence 2) Construire une protéine fusionnée à une protéine fluorescente Dans les 2 cas, l'observation est faite avec un microscope à fluorescence. On peut regarder la localisation de la protéine d'intérêt dans des cellules en culture ou des coupes de tissus. Dans tous les cas, les cellules sont préalablement fixées (elles sont alors immobilisées et les macromolécules sont stabilisées et bloquées en l'état). 88 3) Etude de lexpression des gènes : c) Localisation des protéines

89 Pour localiser des protéines endogènes dans une cellule (ou sur une coupe de tissu), une technique proche du Western blot est utilisée : l'immunofluorescence Cellule fixée sur lamelle et perméabilisée noyau protéine étudiée Analyse du signal fluorescent par observation au microscope à fluorescence => localisation de la protéine d'intérêt lavages Détection de la protéine par un anticorps spécifique (anticorps primaire) après incubation avec de la BSA (bovine serum albumine, pour saturer les sites de liaison non spécifiques) noyau Reconnaissance de l'anticorps primaire par un anticorps secondaire fusionné à un fluorophore 89 3) Etude de lexpression des gènes : c) Localisation des protéines : immunofluorescence

90 On peut fusionner une protéine fluorescente à l'extrêmité C-terminale ou N- terminale de la protéine d'intérêt. Des plasmides contenant les protéines fluorescentes existent, et contiennent des sites de restriction permettant de cloner la protéine d'intérêt. Ex : fusion à la GFP (Green Fluorescent Protein). La GFP est une protéine issue d'une méduse Aequorea victoria, capable d'émettre une fluorescence verte après excitation par une lumière bleue. protéine d'intérêt GFP Excitation par lumière bleue Emission de fluorescence verte Localisation des protéines dans une cellule par observation au microscope à fluorescence 90 3) Etude de lexpression des gènes : c) Localisation des protéines : fusion à une protéine fluorescente

91 Les ARN et ADN peuvent être localisés dans une cellule ou une coupe de tissus grâce à l'hybridation in situ (FISH en anglais, pour Fluorescent in situ hybridization) : Utilisation d'une sonde fluorescente d'ADN complémentaire de l'ARN ou ADN étudié et visualisation sur un microscope à fluorescence. Pour l'ADN chromosomique : les chromosomes sont préalablement exposés à un fort pH ce qui détruit les appariements de bases de l'ADN. La sonde complémentaire de la région étudiée a alors accès à l'ADN. Pour l'ARN : pas d'exposition à un fort pH pour que l'ADN reste bicaténaire et ne fixe pas la sonde. Fixation douce pour que l'ARN soit conservé dans une forme exposée. 91 3) Etude de lexpression des gènes : d) Localisation des ARN et ADN

92 Les sondes utilisées sont souvent de l'ADN. Elles sont fluorescentes. Autrefois les sondes étaient marquées radioactivement. On peut également trouvé des sondes avec un marquage chimique, détecté ensuite par des anticorps. Protocole : les sondes sont dénaturées. Elles sont incubées avec les cellules fixées et perméabilisées en présence d'ARNt et de BSA pour saturer les sites non spécifiques. Des lavages permettent d'éliminer les sondes non fixées, avant l'observation microscopique. 92 3) Etude de lexpression des gènes : d) Localisation des ARN par Hybridation Fluorescente In Situ (FISH)

93 Conclusion : Etude de lexpression des gènes : 93 Les analyses se font de plus en plus à une échelle globale. Exemple : les puces à ADN permettent de comparer lensemble des ARNm présents dans 2 échantillons différents : Collection de molécules dADN, spécifiques de gènes, ampifiées par PCR, puis fixées sur une lame de verre ARNm issus de léchantillon 1 marqués par un fluorochrome rouge ARNm issus de léchantillon 2 marqués par un fluorochrome vert Hybridation sur la lame, lavages, et analyse des signaux fluorescents Les spots rouges correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans léchantillon 1 que dans léchantillon 2 Les spots verts correspondent à des gènes beaucoup plus exprimés dans léchantillon 2 que dans léchantillon 1 Les spots jaunes correspondent à des gènes exprimés de la même façon dans les deux échantillons et les spots noirs à des gènes non exprimés dans les deux échantillons

94 94 II) Utilisation de lADN recombinant 4) Etude de la fonction des gènes/protéines Approche génétique classique : point de départ, des mutants avec un phénotype intéressant ; puis recherche des gènes impliqués Approche génétique inverse : développée grâce à la technologie de lADN recombinant ; il est possible de cibler une mutation dans une séquence donnée. Cette version mutante peut être transférée dans une cellule pour son étude (voir partie B).

95 4) Etude de la fonction des gènes/protéines a) Approche génétique classique 95 Mutagenèse aléatoire : par insertion (dun transposon…), chimique… Crible pour identifier un phénotype intéressant Recherche du/des gènes impliqués - Test de complémentation entre mutants pour savoir si ce sont ou non les mêmes gènes impliqués - Localisation du gène impliqué : - Séquençage autour de linsertion après avoir récupéré le fragment correspondant - Test de liaison (position relative par rapport à dautres gènes connus ou séquences particulières) - Recherche dhomologies de séquence ; étude de lexpression du gène spatiale et temporelle

96 Comment est obtenue une version mutée dun gène ? - Par PCR mutagène (PCR en présence dun déséquilibre entre les différents nucléotides et dun tampon différent) => mutations aléatoires dans la séquence - Par mutagenèse dirigée : PCR avec des amorces particulières => insertion dune mutation à un endroit précis (exemple : modification dun acide aminé particulier) Exemple : Séquence à muter : cag cgc gat ttc Q R D F => remplacement de l'aspartate par une alanine : Séquence de l'amorce: cag cgc gCC ttc Q R A F ADN matrice à muter : le plasmide entier avec la séquence du gène dintérêt à muter amorces utilisées pour la PCR Zone de mésappariement de l'amorce avec la matrice, correspondant à la mutation à introduire On fait une PCR sur un plasmide entier avec des amorces présentant un mésappariement (mutation à introduire) avec la matrice 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse 96

97 A la fin de la PCR de la mutagenèse dirigée on se retrouve avec un mélange de plasmides initiaux sans la mutation et de plasmides contenant la mutation plasmide initial plasmide avec la mutation Le plasmide initial est méthylé car il a été amplifié dans une bactérie (méthylation de séquences d'ADN spécifiques). Afin de sélectionner les plasmides avec la mutation, traitement par une enzyme qui coupe des séquences dADN particulières seulement si elles sont méthylées, puis transformation dans des bactéries. Seul le plasmide muté, non digéré, pourra se répliquer dans les bactéries. 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse 97

98 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : différents types de mutants 98 - Mutation avec gain de fonction : souvent liée à la surexpression du gène (le gène peut être placé sous le contrôle dun promoteur puissant, et sur un plasmide multicopies) - Inactivation de gène (knockouts) - Mutation effet dominant négatif : Pour une protéine entrant dans la formation dun complexe, une mutation peut conduire au dysfonctionnement total de ces protéines, y compris des protéines non mutantes : 4 protéines associées en complexe, protéines actives 4 protéines mutantes associées en complexe, protéines inactives 1 protéine mutante dans le complexe, toutes les protéines sont inactivées

99 4) Etude de la fonction des gènes/protéines b) Approche génétique inverse : utilisation des mutants 99 - Etude des phénotypes des mutants - Complémentation fonctionnelle : (expériences sur des mutants conditionnels) Si restauration de la fonction X : complémentation fonctionnelle (identification dun gène équivalent à celui muté chez la levure dans un autre organisme) Rq : ce test peut aussi mettre en évidence des gènes suppresseurs Levures thermosensibles mutantes pour un gène X Banque dADNc dun autre organisme eucaryote, dans un vecteur levure, avec un marqueur de sélection Transformation des levures, étalement sur milieu sélectif à température permissive (la mutation du gène X ne sexprime pas) Incubation à température permissive : toutes les cellules se développent Incubation à température non permissive (la mutation du gène X sexprime) : seules les cellules ayant une protéine qui complémente le défaut de X poussent

100 100 II) Utilisation de lADN recombinant : Conclusion Gène ou ADNc Protéine Clonage dans un vecteur dexpression Production et purification de protéine recombinante A partir de la séquence partielle en acides aminés, synthèse dune sonde ADN, hybridation sur banque dADN génomique ou ADNc


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