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T Berdous INSERM U716 Pr F Calvo Direction : S Mourah Polymorphismes génétiques des anti-cancéreux.

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1 T Berdous INSERM U716 Pr F Calvo Direction : S Mourah Polymorphismes génétiques des anti-cancéreux

2 PHARMACOGENETIQUE Variabilité interindividuelle de la réponse à un médicament Objectifs => Améliorer la maîtrise de la variabilité interindividuelle Individualiser le traitement médicamenteux : choix de la molécule mais aussi posologie et rythme dadministration Le bon traitement, à la bonne personne et, au bon moment

3 Polymorphismes génétiques Définition: Modification de séquence, stable, observée chez plus d1% de la population -Répétitions en tandem : microsatellites/minisatellite -La plus simple se situe au niveau d'un nucléotide : Single Nucleotide Polymorphism ou SNP Le génome humain : 10 7 de SNP / 3 milliards pb contribuant à la diversité de l'espèce humaine Variations nucléotidiques & conséquences : –séquence acide aminé –l'expression –in fine l'activité Certains polymorphismes sont non fonctionnels ou silencieux, conservation structure et/ou fonction.

4 Conséquences cliniques des différents phénotypes métaboliques pour un médicament à index thérapeutique étroit : anticancéreux

5 La classification des agents anticancéreux se fait suivant leur mécanisme d'action sur le cycle cellulaire et leur appartenance à des familles chimiques. Médicaments altérant l'ADN : - agents intercalants = daunorubicine, anthracyclines (la pluplart sont des antibiotiques) - inhibiteurs de la topoisomérase I et II = irinotécan, étoposide Anticancéreux Inhibiteurs enzymatiques : - de la dihydrofolate réductase = méthotréxate Antimétabolites : - 5-fluoro-uracile Cytokines : - interféron alpha Altération du fuseau mitotique :

6 Métabolisme et transport des Xénobiotiques

7 Objectif Mise au point et validation dune méthode de détection des polymorphismes des gènes MDR1 et UGT1A1, basée sur la technologie de PCR à sonde dhybridation : Polymorphismes des exons 26 et 21du gène MDR1 : transport des Anthracyclines et de lAracytine Polymorphismes de la TATA Box du gène UGT1A1 : toxicité à lIrinotécan Association des SNP avec lexpression génique

8 transporteur le mieux caractérisé de la famille des ATP Binding Casette protéines responsable de lefflux cellulaire danticancéreux (Anthracyclines…) surexprimé (ARN et protéine) dans les cellules cancéreuses P-gp Function MDR1 - P-gp - gp170

9 28 polymorphismes décrits (1236, 2677, 3435) Le SNP 3435C>T sur lexon 26 définit 3 génotypes : CC, CT et TT Fonctionnalité de la Pgp dans les cellules hématopoïétiques moins élevée avec le génotype TT par rapport au CC (Hoffmeyer 2000) mais linverse est trouvé par dautres (Kim 2002) La fréquence de la mutation C>T varie selon les races : génotype CC plus fréquent chez les africains et les afro-américains (83 et 61%) par rapport aux caucasiens (26%) et aux japonais ou chinois (34%) (Schaeffeler 2001); 83-84% versus 48% et 53% (Ameway 2001)

10 Polymorphisme du gène UGT1A1 en réponse à lirinotécan Uridine diphosphate Glucuronyl Transférase : enzyme membranaire Enzyme de phase II, catalyse la glucuronoconjugaison. polymorphisme de répétition dans la TATA box du promoteur ( délétion ou insertion de séquence TA) plusieurs allèles (TA)5, (TA)7, (TA)8 (phénotype sauvage (TA)6). TA7 est associée à létat homozygote, à la maladie de Gilbert (Kadakol 2000). déficit en UGT1A1 est à lorigine dune toxicité sévère (diarrhée, leucopénie) dans le traitement de certains cancers par lirinotécan structure du gène UGT1A1

11 - 9 patients atteints de Leucémie aigue myéloblastique et 20 donneurs sains ont été inclus - les PBMC ont été isolées (Ficoll) - les ADN et ARN des PBMC ont été extraits sur colonnes Qiagen - détection des SNP 3435 C>T (exon 26) et 2677 C>A (exon 21) du gène MDR1 et de UGT1A1 en utilisant la technologie des sondes à hybridation (Roche) - quantification des transcrits MDR1 par RT-PCR quantitative en utilisant la technologie des sondes à hydrolyse (TaqMan) Patients & Méthodes

12 Méthodes Technologie SybrGreen Sondes à Hybridation FluorescéineLCRed 640

13 Résultats - MDR1 mut 3435 neg 150 pb Mut pb PCR point final PCR en SybrGreen

14 Polymorphisme – MDR1 / 3435 C>T Tm nt 3435 : Wt = 56°C Mut = 64°C PCR en Sonde à hybridation

15 Répartition des génotypages MDR1 (n=9) CC CT TT (2/9) (5/9) (2/9) Polymorphisme –MDR1 / C3435T

16 Polymorphisme – MDR1 / C2677A Homozygote sauvage 2677 Pas de mutation Tm 59°C

17 Quantification des transcrits MDR1 et SNP 2 donneurs sains homozygotes sauvages Moyenne dexpression des transcrits MDR1 : 21.3 et 566 copies de MDR1/10 6 copies 2m respectivement dans les 2 groupes (20 donneurs sains et 9 LAM). Association C3435T : Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5) Identification échantillonGénotypeTanscrits MDR1 (copies/10 6 copies 2m) C CT / Hétérozygote 2115 C C C C C CC / Homozygote sauvage 1536 C16 4 C TT / Homozygote muté 643 C121 39

18 Tm 40°C 46°C 40°C Répartition des génotypages UGT1A1 (n=6) TA6/TA7 TA6/TA6 (4/6) (2/6) Résultats – UGT1A1 sonde TA7 Selon la méthodologie décrite par Von Ahsen en 2000

19 Discussion Identification fiable et reproductible des différents polymorphismes MDR1 et UGT1A1 étudiés MDR1 C3435T : Détection de différents profils dans les LAM (hétérozygotes, homozygote muté/sauvage), Donneurs sains homozygotes sauvages 3435CC C2677A : un seul génotype : homozygote sauvage Ces fréquences sont en accord avec celles rapportées par dautres équipes. La mutation C2677A est décrite comme rare (Hoffmeyer et al 2003)

20 Association SNP et expression de MDR1 : - Illmer et al 2002, association phénotype-génotype des polymorphismes MDR1 (n = 405 patients) : C3435T, C2677A & C1236T - Association C3435T : Hétérozygote et surexpression de MDR1 (4/5) Discussion

21 UGT1A1 Sonde TA7, caractérisation de 2 profils génotypiques : - homozygote sauvage TA6/TA6 - hétérozygote muté TA6/TA7 - les autres génotypes non mis en évidence groupe restreint Le génotypage de ces polymorphismes est réalisable avec les sondes TA6, TA8 (validation des résultats). Optimisation de la méthode décrite par Von Ahsen et al Détection des différents génotypes en utilisant une seule sonde TA7

22 Conclusion & Perspectives Mise au point et validation de la détection des SNP C3435T, C2677A (MDR1) et polymorphismes UGT1A1 par sonde à hybridation Méthode reproductible et fiable, spécifique et sensible (picogrammes dADN) Evaluer les conséquences cliniques et thérapeutiques de ces SNP Association phénotype-génotype Mise à disposition du médecin de tests de dépistage de polymorphismes génétiques, réalisables en routine, permettant de prédire lefficacité ou la toxicité dun traitement pour un individu donné.

23 Sonde Génotype Tm par Tm PCR Thermodynamie UGT1A1 TA5 35,4°C 36,3°C TA6 39,9°C 39°C TA7 46,2°C 46,4°C TA8 42,2°C 41,3°C Nos résultats sont en accord avec ceux décrits par Von Ahsen en 2000

24 Mécanismes moléculaires à lorigine dune anomalie du métabolisme


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