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FML 13-12-04 PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510,

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Présentation au sujet: "FML 13-12-04 PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510,"— Transcription de la présentation:

1 FML PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, DIJON CEDEX, et

2 Démonstration de PCR quantitative 1.Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) 2.Exemple dapplications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) 3. Démonstration de lutilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent) 4.Démonstration de lutilisation de lABI7900 (D Bru

3 Principe de la PCR conventionnelle Dénaturation du double brin dADN et hybridation des amorces Elongation Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol 72°C 55°C 95°C 72°C x 35 cycles Séparation électrophorétique FML

4 PCR conventionnelle versus PCR quantitative Analyse en point final sur gel dagarose Phase exponentielle Phase linéaire Phase plateau Analyse dynamique de la PCR quantitative -haute précision pendant la phase exponentielle -variabilité importante à la phase plateau FML

5 PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -lactivité 5-exonucléase de la Taq Pol FP RP Reporter Quencher FAM, VICTAMRA -Spécificité lamorce pour la PCR -Spécificité de lhybridation de la sonde TaqMan FML

6 FP RP R Q -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte Fluorescence Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan® FML

7 Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan® -au cours de lélongation catalysée par la Taq Pol lactivité 5 nucléase déplace la sonde FP RP R Q FP RP R Q -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule dADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML

8 nm Absorbtion Fluorescence FAM nm Absorbtion Fluorescence TAMRA -Le spectre demission du Reporteur recouvre le spectre dabsorption du Quencher -FRET Mécanisme de quenching Excitation Émission FRET FML

9 TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné) NFQ R MGB FML

10 PCR quantitative SYBR ®Green Mesure de fluorescence en fin délongation FML

11 TaqMan ® versus SYBR ® Green TaqMan ®SYBR ® Green Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - -utilisation damorces dégénérées Optimisation -standardisée-dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère damorces FML

12 ROX comme référence passive Le marqueur fluorescent ROX permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…) ROX Echantillon 2 FAM ROX Echantillon 1 FAM Fluorescence Rn Rn= Reporter / Passive référence FML

13 Détermination du Ct (cycle seuil) Bruit de fond cycle Rn 10 2O3O4O5O Ligne de base Ct La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à lintersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence FML

14 Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre dADN cibles initialement présents Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Ct FML

15 Quantification absolue Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) Ct Résultat : léchantillon dADN (ex: 25 ng) contient copies du gène cible FML

16 Efficacité de la PCR quantitative Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Efficacité = 10 (-pente) -1 Exemple pente = E = 10 (0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 % atzA Si la pente est égale à alors lefficacité de la PCR quantitative est de 100 % FML

17 PCR efficace à 100% y = x (1 + E) n cas spécifique E = 1 alors y = x 2 n y=nombre de copie du gène cible x=nombre de copie initiale E=efficacité n=nombre de cycle PCR Quand E = 1 alors : Ct = + 1 augmentation x2 Ct= augmentation x10 FML

18 Quantification relative o pas besoin de courbe de standard o calcul des résultats pas comparaisons des Ct o nécessité de définir : - un gène cible servant de contrôle endogène, - un gène cible servant de standard. le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais dextraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations défficacité de transcription inverse FML

19 Standard t=0 t=2t=4t=7t=14t=21 -t0 ajout datrazine à des mésocosmes de sol, -t0 sera utilisé comme valeur standard FML

20 Contrôle endogène Gène cible Ct = 22 – 16 = 6 Ct=16 Ct=22Cycle Rn Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène Ct=16 Ct=22Cycle Rn Ct=21 Ct=15 Contrôle endogène Gène cible Ct = 21 – 15 = 6 Si 2 x plus de matrice ? FML

21 Comparaison de Ct Ct=16 Ct=26Cycle Rn t2 Ct=12 Ct=22Cycle Rn t4 Ct=15 Ct=31Cycle Rn t7 Ct=16 Ct=32Cycle Rn t0 Contrôle endogène Gène cible FML

22 Comparaison de Ct Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Etape 2: normalisation par rapport au standard Ct échantillon - Ct standard = Ct Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible 2 - Ct FML

23 Quantification relative des résultats standard Augmentation par x t0 t2 t4 t7 FML

24 Exercice (1/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Quel échantillon dADN est le plus concentré et de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène…. FML

25 Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2 Ct 16SrRNA = 2 2 = 4 La concentration dADN de léchantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de léchantillon atrazine. Exercice (2/4) FML

26 Exercice (3/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Quel échantillon dADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ? FML

27 Exercice (4/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Ct contrôle = 32 – 14 = 18 Ct atrazine = 29 – 16 = 13 Ct = 18 – 13 = 5 2 Ct = 2 5 = 32 Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans léchantillon de sol traité avec latrazine que dans le contrôle FML

28 Analyse de la structure des communautés microbiennes RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis Amplification PCR Amorces universelles : 38f et 72r IGS 3 5 A 16 S 23 S 5 3 IGS B 16 S23 S MM kpb Profils de bandes complexes numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes) FML

29 LPFPHP U LDSSLDCSS LDCSS- HAP SS100 SS10 FM U IA L La BouzulePierrelayeCouhins Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP FML

30 HP FP LP PC1 30% PC2 21% Pierrelaye FM U SS10 SS100 PC2 15.2% PC1 45.3% Couhins Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. La Bouzule U LDSS LDCSS LDCSS- HAP PC1 30% PC2 20% U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP FML

31 Cinétique de minéralisation de l atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. La Bouzule PierrelayeCouhins FML

32 Potentiel génétique de minéralisation de l atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. aa a a a b ab b a a b b b b b b a a a a a a b b b b aa FML

33 1. Transcription inverse dARNm cibles en ADNc Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre dADN cibles initialement présents 2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 PRINCIPE DE LA RT-qPCR 1 ARNm = 1 ADNc Ct FML

34 NN N NHCH 2 CH 3 (CH 3 ) 2 CH 2 HN Cl atrazine OH NN N NHCH 2 CH 3 (CH 3 ) 2 CH 2 HN Hydroxyatrazine atzA Acide cyanurique N-isopropylammélide NN N OH (CH 3 ) 2 CH 2 HN OH atzB HO N N N OH atzC CO 2 + NH 4 + atzF NHNH O O Biuret NH 2 atzD atzE O NHNH O O H2NH2N Allophanate - VOIE DE MINÉRALISATION DE LATRAZINE H2NH2N FML

35 Niveau dexpression de lADNr 16S la quantité dARNr 16S est stable pendant lexpérience LARNr 16S = référence interne pour la mesure de lexpression des gènes atz au cours du temps Temps (min) ARNr 16S / ng dARN extrait FML

36 Niveau dexpression des gènes atzA, B et C LEXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE P.ADP - ATRAZINE : Expression basale des gènes atz + ATRAZINE : Augmentation transitoire de lexpression des gènes atz Temps (min) ARNm /10 6 ARNr 16S atzA atzB atzC P.ADP C. heintzii - ATRAZINE : seul atzA sexprime + ATRAZINE : Augmentation de lexpression des gènes atzA et B Pas dexpression datzC Temps (min) ARNm /10 6 ARNr 16S atzA atzB atzC C. heintzii FML

37 Niveau dexpression des gènes atzD, E et F En absence datrazine, atzD, E et F sexpriment de façon basale Lexpression datzD et atzE augmentent 300 min après lajout datrazine x 20x 150 Lexpression datzF nest pas affectée par lajout datrazine Augmentation de lexpression des gènes de lopéron atzDEF selon un gradient FML


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