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FML 13-12-04 PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510,

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1 FML 13-12-04 PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr fmartin@dijon.inra.frdavid.bru@dijon.inra.fr

2 Démonstration de PCR quantitative 1.Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) 2.Exemple dapplications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) 3. Démonstration de lutilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent) 4.Démonstration de lutilisation de lABI7900 (D Bru

3 Principe de la PCR conventionnelle Dénaturation du double brin dADN et hybridation des amorces Elongation Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol 72°C 55°C 95°C 72°C x 35 cycles Séparation électrophorétique FML 13-12-04

4 PCR conventionnelle versus PCR quantitative Analyse en point final sur gel dagarose Phase exponentielle Phase linéaire Phase plateau Analyse dynamique de la PCR quantitative -haute précision pendant la phase exponentielle -variabilité importante à la phase plateau FML 13-12-04

5 PCR quantitative avec une sonde TaqMan® Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -lactivité 5-exonucléase de la Taq Pol 5 5 3 3 FP RP Reporter Quencher FAM, VICTAMRA -Spécificité lamorce pour la PCR -Spécificité de lhybridation de la sonde TaqMan FML 13-12-04

6 5 5 3 3 FP RP R Q -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte Fluorescence Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan® FML 13-12-04

7 Essais 5 nucléase avec la sonde TaqMan® -au cours de lélongation catalysée par la Taq Pol lactivité 5 nucléase déplace la sonde 5 5 3 3 FP RP R Q 5 5 3 3 FP RP R Q -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule dADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML 13-12-04

8 nm Absorbtion Fluorescence 475550 FAM nm 550 600 Absorbtion Fluorescence TAMRA -Le spectre demission du Reporteur recouvre le spectre dabsorption du Quencher -FRET Mécanisme de quenching Excitation Émission FRET FML 13-12-04

9 TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné) NFQ R MGB FML 13-12-04

10 PCR quantitative SYBR ®Green Mesure de fluorescence en fin délongation FML 13-12-04

11 TaqMan ® versus SYBR ® Green TaqMan ®SYBR ® Green Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - -utilisation damorces dégénérées Optimisation -standardisée-dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère damorces FML 13-12-04

12 ROX comme référence passive Le marqueur fluorescent ROX permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…) ROX Echantillon 2 FAM ROX Echantillon 1 FAM Fluorescence Rn Rn= Reporter / Passive référence FML 13-12-04

13 Détermination du Ct (cycle seuil) Bruit de fond cycle Rn 10 2O3O4O5O 1 2 3 4 Ligne de base Ct La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à lintersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence FML 13-12-04

14 Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre dADN cibles initialement présents Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 10 1 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Ct FML 13-12-04

15 Quantification absolue Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 10 1 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 Ct Résultat : léchantillon dADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible FML 13-12-04

16 Efficacité de la PCR quantitative Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26Ct + 10,85 R 2 = 0,998 Efficacité = 10 (-pente) -1 Exemple pente = -0.26 E = 10 (0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 % atzA Si la pente est égale à 0.301 alors lefficacité de la PCR quantitative est de 100 % FML 13-12-04

17 PCR efficace à 100% y = x (1 + E) n cas spécifique E = 1 alors y = x 2 n y=nombre de copie du gène cible x=nombre de copie initiale E=efficacité n=nombre de cycle PCR Quand E = 1 alors : Ct = + 1 augmentation x2 Ct= + 3.32 augmentation x10 FML 13-12-04

18 Quantification relative o pas besoin de courbe de standard o calcul des résultats pas comparaisons des Ct o nécessité de définir : - un gène cible servant de contrôle endogène, - un gène cible servant de standard. le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais dextraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations défficacité de transcription inverse FML 13-12-04

19 Standard t=0 t=2t=4t=7t=14t=21 -t0 ajout datrazine à des mésocosmes de sol, -t0 sera utilisé comme valeur standard FML 13-12-04

20 Contrôle endogène Gène cible Ct = 22 – 16 = 6 Ct=16 Ct=22Cycle Rn Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène Ct=16 Ct=22Cycle Rn Ct=21 Ct=15 Contrôle endogène Gène cible Ct = 21 – 15 = 6 Si 2 x plus de matrice ? FML 13-12-04

21 Comparaison de Ct Ct=16 Ct=26Cycle Rn t2 Ct=12 Ct=22Cycle Rn t4 Ct=15 Ct=31Cycle Rn t7 Ct=16 Ct=32Cycle Rn t0 Contrôle endogène Gène cible FML 13-12-04

22 Comparaison de Ct Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Etape 2: normalisation par rapport au standard Ct échantillon - Ct standard = Ct Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible 2 - Ct FML 13-12-04

23 Quantification relative des résultats 64 11 standard Augmentation par x t0 t2 t4 t7 FML 13-12-04

24 Exercice (1/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Quel échantillon dADN est le plus concentré et de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène…. FML 13-12-04

25 Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2 Ct 16SrRNA = 2 2 = 4 La concentration dADN de léchantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de léchantillon atrazine. Exercice (2/4) FML 13-12-04

26 Exercice (3/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Quel échantillon dADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ? FML 13-12-04

27 Exercice (4/4) Contrôle 16S rRNACt 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzACt29 Ct contrôle = 32 – 14 = 18 Ct atrazine = 29 – 16 = 13 Ct = 18 – 13 = 5 2 Ct = 2 5 = 32 Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans léchantillon de sol traité avec latrazine que dans le contrôle FML 13-12-04

28 Analyse de la structure des communautés microbiennes RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis Amplification PCR Amorces universelles : 38f et 72r IGS 3 5 A 16 S 23 S 5 3 IGS B 16 S23 S 12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50 0.404 1.114 MM 0.900 0.124 0.147 0.190 0.242 kpb Profils de bandes complexes numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes) FML 13-12-04

29 LPFPHP U LDSSLDCSS LDCSS- HAP SS100 SS10 FM U IA 900 692 501 484 404 320 L La BouzulePierrelayeCouhins Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP FML 13-12-04

30 -0.15 0.25 -0.250.15 HP FP LP PC1 30% PC2 21% Pierrelaye -0.2 0.16 -0.160.35 FM U SS10 SS100 PC2 15.2% PC1 45.3% Couhins Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. La Bouzule -0.15 0.16 -0.160.16 U LDSS LDCSS LDCSS- HAP PC1 30% PC2 20% U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP FML 13-12-04

31 Cinétique de minéralisation de l atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. La Bouzule PierrelayeCouhins FML 13-12-04

32 Potentiel génétique de minéralisation de l atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule. aa a a a b ab b a a b b b b b b a a a a a a b b b b aa FML 13-12-04

33 1. Transcription inverse dARNm cibles en ADNc Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre dADN cibles initialement présents 2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 10 1 10 6 10 5 10 4 10 3 10 2 Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R 2 = 0,998 PRINCIPE DE LA RT-qPCR 1 ARNm = 1 ADNc Ct FML 13-12-04

34 NN N NHCH 2 CH 3 (CH 3 ) 2 CH 2 HN Cl atrazine OH NN N NHCH 2 CH 3 (CH 3 ) 2 CH 2 HN Hydroxyatrazine atzA Acide cyanurique N-isopropylammélide NN N OH (CH 3 ) 2 CH 2 HN OH atzB HO N N N OH atzC CO 2 + NH 4 + atzF NHNH O O Biuret NH 2 atzD atzE O NHNH O O H2NH2N Allophanate - VOIE DE MINÉRALISATION DE LATRAZINE H2NH2N FML 13-12-04

35 Niveau dexpression de lADNr 16S la quantité dARNr 16S est stable pendant lexpérience LARNr 16S = référence interne pour la mesure de lexpression des gènes atz au cours du temps Temps (min) ARNr 16S / ng dARN extrait FML 13-12-04

36 Niveau dexpression des gènes atzA, B et C LEXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE P.ADP - ATRAZINE : Expression basale des gènes atz + ATRAZINE : Augmentation transitoire de lexpression des gènes atz Temps (min) ARNm /10 6 ARNr 16S atzA atzB atzC P.ADP C. heintzii - ATRAZINE : seul atzA sexprime + ATRAZINE : Augmentation de lexpression des gènes atzA et B Pas dexpression datzC Temps (min) ARNm /10 6 ARNr 16S atzA atzB atzC C. heintzii FML 13-12-04

37 Niveau dexpression des gènes atzD, E et F En absence datrazine, atzD, E et F sexpriment de façon basale Lexpression datzD et atzE augmentent 300 min après lajout datrazine x 20x 150 Lexpression datzF nest pas affectée par lajout datrazine Augmentation de lexpression des gènes de lopéron atzDEF selon un gradient FML 13-12-04


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