F Martin-Laurent et D Bru

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1 F Martin-Laurent et D Bru
PCR Quantitative F Martin-Laurent et D Bru UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, DIJON CEDEX, et FML

2 Démonstration de PCR quantitative
Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent) Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent) Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru

3 Principe de la PCR conventionnelle
Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol Elongation 72°C 55°C 95°C x 35 cycles Séparation électrophorétique FML

4 PCR conventionnelle versus PCR quantitative
Analyse en point final sur gel d’agarose Phase plateau Analyse dynamique de la PCR quantitative haute précision pendant la phase exponentielle variabilité importante à la phase plateau Phase linéaire Phase exponentielle FML

5 PCR quantitative avec une sonde TaqMan®
Cette méthode repose sur deux principes : -la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) -l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol 5’ 3’ FP RP Reporter Quencher FAM, VIC TAMRA -Spécificité l’amorce pour la PCR -Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan FML

6 Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
Fluorescence 5’ 3’ FP RP R Q -FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie), pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte FML

7 Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®
-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde 5’ 3’ FP RP R Q 5’ 3’ FP RP R Q -lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML

8 FAM TAMRA Mécanisme de quenching nm nm
Excitation -Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher nm Absorbtion Fluorescence 475 550 FAM FRET nm 550 600 Absorbtion Fluorescence TAMRA -FRET Émission FML

9 TaqMan® MGB probes NFQ non fluorescent quencher Nouvelle innovation
MGB minor groove binder stabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’) sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné) FML

10 PCR quantitative SYBR ®Green
Mesure de fluorescence en fin d’élongation FML

11 TaqMan ® versus SYBR ® Green
Spécificité -fixation des amorces, -hybridation de la sonde, -conditions PCR -fixation des amorces, - -conditions PCR Flexibilité -multiplexe, -détection de SNP, - - -utilisation d’amorces dégénérées Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé -vérifier la formation de dimère d’amorces FML

12 ROX™ comme référence passive
Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…) ROX Echantillon 2 FAM Echantillon 1 Fluorescence Rn Rn= Reporter / Passive référence FML

13 Rn Ct cycle Détermination du Ct (cycle seuil)
10 2O 3O 4O 5O 1 2 3 4 Ct La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence Bruit de fond Ligne de base FML

14 Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct
Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML

15 Quantification absolue
Nombre de copies (log) Cycle seuil - Ct Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Fluorescence émise (UA) 101 106 105 104 103 102 Ct Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient copies du gène cible FML

16 Efficacité de la PCR quantitative
Log N = -0,26Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de copies (log) Efficacité = 10(-pente) -1 atzA Cycle seuil - Ct Exemple pente = -0.26 E = 10(0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 % Si la pente est égale à alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 % FML

17 cas spécifique E = 1 alors
PCR efficace à 100% y = x (1 + E)n Quand E = 1 alors : Ct = + 1  augmentation x2 Ct=  augmentation x10 cas spécifique E = 1 alors y = x 2n y=nombre de copie du gène cible x=nombre de copie initiale E=efficacité n=nombre de cycle PCR FML

18 Quantification relative
pas besoin de courbe de standard calcul des résultats pas comparaisons des Ct nécessité de définir : un gène cible servant de contrôle endogène, un gène cible servant de standard. le contrôle endogène : - donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc), - est présent en quantité constante dans tous les échantillons, - normalise : - les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN) - les variations d’éfficacité de transcription inverse FML

19 Standard -t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,
-t0 sera utilisé comme valeur standard FML

20 Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène
Ct=16 Ct=22 Cycle Rn Contrôle endogène Gène cible Ct = 22 – 16 = 6 Si 2 x plus de matrice ? Ct=16 Ct=22 Cycle Rn Ct=21 Ct=15 Contrôle endogène Gène cible Ct = 21 – 15 = 6 FML

21 Comparaison de Ct t0 t2 t4 t7 Contrôle endogène Gène cible Ct=16 Ct=32
Cycle Rn t0 Contrôle endogène Gène cible Ct=16 Ct=26 Cycle Rn t2 Ct=12 Ct=22 Cycle Rn t4 Ct=15 Ct=31 Cycle Rn t7 FML

22 2-Ct Comparaison de Ct
Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct Etape 2: normalisation par rapport au standard Ct échantillon - Ct standard = Ct Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible 2-Ct FML

23 Quantification relative des résultats
64 64 t4 Augmentation par x t7 1 1 standard FML

24 Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ?
Exercice (1/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ? 16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène…. FML

25 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2Ct 16SrRNA = 22 = 4 Exercice (2/4) Contrôle
atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2 2Ct 16SrRNA = 22 = 4 La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine. FML

26 Exercice (3/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine
Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de la séquence atzA ? FML

27 Ct contrôle= 32 – 14 = 18 Ct atrazine= 29 – 16 = 13
Exercice (4/4) Contrôle 16S rRNA Ct 14 atzA Ct 32 Atrazine 16S rRNA Ct 16 atzA Ct29 Ct contrôle= 32 – 14 = 18 Ct atrazine= 29 – 16 = 13 Ct = 18 – 13 = 5 2Ct = 25 = 32 Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle FML

28 Analyse de la structure des communautés microbiennes
Amplification PCR Amorces universelles : 38f et 72r IGS 5’ A 16 S 23 S 3’ RISA : Ribosomal Intergenic Spacer Analysis IGS 5’ B 16 S 23 S 3’ MM MM MM MM kpb • Profils de bandes complexes • numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes) 1.114 0.900 0.404 0.242 0.190 0.147 0.124 FML

29 Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
LDSS LDCSS LDCSS- HAP SS100 SS10 FM U IA 900 692 501 484 404 320 L LP FP HP Couhins Pierrelaye La Bouzule U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML

30 Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
-0.15 0.16 -0.16 U LDSS LDCSS LDCSS-HAP PC1 30% PC2 20% -0.2 0.16 -0.16 0.35 FM U SS10 SS100 PC2 15.2% PC1 45.3% Couhins -0.15 0.25 -0.25 0.15 HP FP LP PC1 30% PC2 21% Pierrelaye U : contrôle LDSS : boue deshydratée LDCSS : boue deshydratée compostée LDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP U : contrôle FM : fumier 10t/h/an SS10 : boue 10t/h/an SS100 : boue 100t/h/an LP : pollution faible FP : pollution moyenne HP : pollution élevée FML

31 Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
FML

32 Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.
FML

33 PRINCIPE DE LA RT-qPCR Ct
1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc 1 ARNm = 1 ADNc 2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR Nombre de copies (log) Fluorescence émise (UA) Ct 106 105 104 103 102 101 Log N = -0,26 Ct + 10,85 R2= 0,998 Nombre de cycles Cycle seuil - Ct Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents FML

34 VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE
Acide cyanurique N-isopropylammélide N OH (CH3)2CH2HN atzB HO atzC N NHCH2CH3 (CH3)2CH2HN Cl atrazine OH N NHCH2CH3 (CH3)2CH2HN Hydroxyatrazine atzA atzD H2N NH2 O N H O Biuret atzE - H2N O O N H O Allophanate atzF CO2 + NH4+ FML

35 Niveau d’expression de l’ADNr 16S
ARNr 16S / ng d’ARN extrait Temps (min) Temps (min) la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps FML

36 Niveau d’expression des gènes atzA, B et C
P.ADP - ATRAZINE : Expression basale des gènes atz + ATRAZINE : Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz Temps (min) ARNm /106ARNr 16S atzA atzB atzC C. heintzii - ATRAZINE : seul atzA s’exprime + ATRAZINE : Augmentation de l’expression des gènes atzA et B Pas d’expression d’atzC Temps (min) ARNm /106ARNr 16S atzA atzB atzC L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE FML

37 Niveau d’expression des gènes atzD, E et F
500 1 000 1 500 2 000 100 200 300 400 Time (min) Relative number of mRNA b ab a atzF 50 150 250 350 atzE 20 40 60 80 120 140 160 Temps (min) x 150 En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale L’expression d’atzD et atzE augmentent 300 min après l’ajout d’atrazine x 20 L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient FML