La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour limagerie du vivant Exemples dapplications à létude du développement végétal Biologie.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour limagerie du vivant Exemples dapplications à létude du développement végétal Biologie."— Transcription de la présentation:

1 La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour limagerie du vivant Exemples dapplications à létude du développement végétal Biologie Cellulaire François Roudier Equipe Différenciation et Identité Cellulaire

2 Aequorea victoria : linventeur de la GFP

3 La GFP : une protéine fluorescente par transfert dénergie

4 La GFP : une structure en lanterne et un fluorophore protéique auto-catalytique aa (26 kDa), N- et C-terminal accessibles - Forte stabilité : résiste à 65 C, à pH entre 5,5-12,2, 8M urée, 1% SDS, protéases (2j)

5 De la GFP sauvage à la GFP améliorée Un outil versatile pour létude du vivant… Plusieurs mutations ont été introduites pour : - Optimiser lexpression de la protéine Usage optimal des codons et élimination dun intron cryptique (20X plus de protéine) Maturation du fluorophore (4X plus vite) - Modifier les propriétés spectrales de la protéine Pic dexcitation unique à 490 nm Brillance (X6)

6 La GFP : une protéine non toxique pour des méthodes de visualisation non invasives

7 Variants de la GFP et autres protéines fluorescentes CFP GFP YFP (DsRED) RFP Discosoma striata

8 Des protéines fluorescentes avec différentes propriétés spectrales

9 Une plante modèle: Arabidopsis thaliana

10 Embryon Adulte Zygote Plante Animal Le développement végétal est essentiellement post-embryonnaire et résulte de lactivité constante des méristèmes Organogenèse et Croissance indéterminée

11 Arabidopsis adulte Méristème apical Méristème racinaire Les méristèmes contiennent les cellules souches et sont organisés en domaines fonctionnels

12 Exemples dapplication de la technologie GFP à létude du développement des plantes - Profil dexpression dun gène Localisation subcellulaire Interaction protéine-protéine (FRET) pPromoteur:GFP (fusion transcriptionnelle) - Etude fonctionnelle dune protéine pPromoteur:CDS::GFP (fusion traductionnelle) Mouvement - Biosenseurs

13 Division asym é trique Le méristème racinaire : une organisation dépendante de divisions stéréotypées des cellules souches

14 Deux mutants d é ficients dans la mise en place et la diff é renciation de l endoderme

15 Expression de SCR dans la racine GFP gene Promoteur SCR ARN GFP Protéine GFP GFP pSCR QC endodermis cortex c/e initiale

16 Localisation de la protéine de fusion SCR::GFP SCR gene ARN SCR::GFP Promoteur SCR GFP QC endodermis cortex c/e initiale pSCR GFPSCR (Complémentation du mutant scr)

17 QC endodermis cortex c/e initiale QC endodermis cortex c/e initiale SCR est nécessaire pour la mise et place et la différenciation de lendoderme dans la racine pSCR GFPSCR GFP pSCR

18 GFP pSHR GFPSHR pSHR st en co ep in qc st en co ep in qc SHR contrôle la mise et place et la différenciation de lendoderme dans la racine de façon non cellule-autonome … … La protéine SHR bouge de la stèle vers lendoderme !

19 pSCR:GFP Plantules in vitro Récolte pointe racinaire (15000) Digestion paroi Triage par fluorescence des protoplastes GFP+ Extraction ARN Amplification Marquage des sondes Hybridation Puce Affymetrix ATH1 25K gene arrays Analyse du transcriptome de lendoderme racinaire protoplastes

20 Collection de marqueurs spécifique dun type cellulaire Pericycle Endo- dermis Lateral rootcap Epidermis QC Endo + Cortex

21 Le méristème apical caulinaire

22 Le méristème apical caulinaire : Une zonation fonctionnelle pour la croissance, lorganogenèse et auto-maintien ZC ZM Auto maintien Tige Organes latéraux

23 Le méristème apical caulinaire Une organogenèse dynamique et structurée Vue davion Cinétique sur 65h Acquisition toutes les 2h30

24 SHOOT MERISTEMLESSLEAFY AINTEGUMENTA CLAVATA3ATML1 CLAVATA1 CUP-SHAPED COTYLEDONS WUSCHEL Marqueurs moléculaires des zones fonctionnelles et identités cellulaires du MAC

25 pANT:GFP, un marqueur de linitiation et de la mise en place des primordia foliaires pANT:GFP Coloration vitale + pANT::GFP

26 Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération T = 0h T = 48h pANT:GFP T = 24h T = 32h

27 après le recrutement : prolifération cellulaire Dynamique de la différenciation des primordia : recrutement puis prolifération

28 P7 P4 P5 P3 P6 P2 P1 Phyllotaxie : initiation des primordia en 3D P0 Une disposition en spirale prédictible

29 Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

30

31

32 Lauxine, une phytohormone transportée de façon polarisée, est impliquée dans le contrôle de la phyllotaxie Phyllotaxie et théorie des champs inhibiteurs

33 AIA - H++H++ Sens du TPA AIAH PIN AUX Transporteur dinflux (membrane apicale) Transport polarisé de lauxine (AIA): Localisation des transporteurs à laide de FPs AUX1::YFP pAUX1:AUX1::YFP pPIN1:PIN1::GFP Transporteur defflux (membrane basale)

34 Auxine Modèle du contrôle de la phyllotaxie par PIN1 et des flux dauxine (DR5:GFP) (pDR5 : 9 x AuxREs) pDR5:GFP Un senseur transcriptionnel de lauxine P0 P1 P2 P3 Gradients locaux dauxine par pompage

35 Interaction entre deux protéines

36 DA A D 1- Compatibilité spectrale des fluorochromes 2- Proximité moléculaire des fluorochromes Mesure de linteraction entre deux protéines par "Fluorescence Resonance Energy Transfert » (FRET) GFP RFP Co-localisation de deux protéines…

37 Application de la technology FRET au vivant : la protéine caméléon, un biosenseur du calcium Mesure ratiométrique de flux calciques chez le ver, C. elegans

38 [Ca 2+ ] forte [Ca 2+ ] faible YFP/CFP élevé (FRET max) YFP/CFP faible (peu de FRET) [Ca 2+ ] nulle CFP séparée de YFP (pas de FRET) Excitation 440 nm

39 Exemples dapplication de la technologie GFP - Profil dexpression de gènes Localisation subcellulaire Interaction protéine-protéine (FRET) - Etude fonctionnelle de protéines Mouvement - Biosenseurs Limites : - Sensibilité (difficile de détecter les gènes faiblement exprimés) - Ajout dune protéine (encombrement, environnement bio) - Panoplie de FPs encore limitée Quelques limites LHP1::GFP

40

41

42 Début de floraison Transformation de la lignée germinale Sélection des transformants à partir des graines Principe de transformation génétique stable chez les plantes

43 Etapes de développement Assises cellulaires In situ digitale des différents types cellulaires de la racine


Télécharger ppt "La Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine incontournable pour limagerie du vivant Exemples dapplications à létude du développement végétal Biologie."

Présentations similaires


Annonces Google