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Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Saint-Pères 15 Juin 2008 La génomique nouvel observatoire du monde microbien Université de.

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1 Jean Weissenbach (Genoscope – Centre national de séquençage) Saint-Pères 15 Juin 2008 La génomique nouvel observatoire du monde microbien Université de tous les savoirs

2 Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684Antonie van Leeuwenhoek

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4 Quelques dates de l'histoire de la microbiologie 1684Antonie van Leeuwenhoek 1838Schwann (levure ferment vivant) 1857Pasteur (fermentation lactique) 1860Pasteur (fermentation alcoolique) 1864Pasteur (génération spontanée) 1881Koch (cultures pures)

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7 Postulats de Koch Par l'utilisation de cultures pures on peut montrer que des organismes distincts ont des propriétés biologiques différentes

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10 Au cours des années 70 Carl Woese procède à des comparaisons systématiques de séquences d ARN des ribosomes de bactéries

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13 TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCTTGAACGAGCGCAACCCCTG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTG TGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TGTCGTGAGATGTTGGGGTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTA TGCCGTGAGGTGTACCCTTAAGTGGGGAAACGAGCGTAACCCCTA abcdefgabcdefg fg e acb d

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18 Inventaire moléculaire de la diversité despèces ADN Extraction Echantillon de l'environnement PCR gènes dARNr 16S amplifiés Clonage dans E. coli Clones séquençage sequences dARNr 16S Analyse de séquences

19 Inventaire moléculaire de la diversité despèces ADN Extraction séquençage PCR gènes dARNr 16S amplifiés Clonage dans E. coli Clones sequences dARNr 16S Analyse de séquences Extraction Echantillon de l'environnement

20 Par cette approche Norman Pace observe dans les années 90 des séquences de rDNA qui ne correspondent pas à des espèces connues cultivées.

21 MinimumOptimumMaximum TempératureélevéethermophilePyrolobus fumarii90°C106°C113°C bassepsychrophilePolaromonas vacuolata0°C4°C12°C pHacideacidophilePicrophilus oshimae0,060,7 (60°C)4 alcalinalcalinophileNatrialba magadii8,5912 pressionélevéebarophile MT41 (Mariana Trench) mètres de profondeur 500 atm 700 atm 4°C > 1000 atm salinitéélevéehalophile Halobacterium salinarum 15 %25 % 32 % (saturation) Les bactéries sont partout, nombreuses et vivent parfois dans des conditions particulièrement inhospitalières …

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25 Avec l'augmentation de leur nombre, une compétition s'est instaurée pour les sources énergie matières premières (minérales ou organiques) Pour échapper à la compétition les bactéries ont recouru à l'innovation 1) en diversifiant leurs sources d'énergie et de matières premières 2) en s'adaptant à des environnements particuliers

26 énergie oxydoréductions chimiques différents oxydants, différents réducteurs lumière plusieurs utilisations de la lumière avec ou sans production d'O2 matières premières (minérales ou organiques) C minéral (CO2 ou organique) N atmosphérique ou sels conditions du milieu température pH ions

27 Streptococcus pneumoniae Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Salmonella Pseudomonas Vue en m.e coloration négative vue en m. e à balayage Chondromyces

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29 HabitatNombre de bactéries% de bactéries cultivables Sol / kg0,01 - 0,1 Rivières, lacs / l0,01 - 0,1 Océans (surface) / l0, ,1 Océans (profondeur) / lindéterminé Océans (sédiments) / l< 1 % Plus de 99% des bactéries sont encore inconnues de nos jours

30 Sols 10 7 à bactéries / g Eauxpotable en généralmaximum 1000 bactéries / mL bassin de natation100 bactéries / mL mer peu polluée bactéries / mL Alimentslait stérilisémaximum 100 bactéries / mL viande hachée10 6 bactéries / g Corps humain sain et propre peau du dos100 à 1000 bactéries / cm2 peau des aisselles ou du pubis 10 6 bactéries / cm2 fèces50 % de la masse soit bactéries / g Les bactéries sont partout et nombreuses...

31 La flore intestinale humaine Cent mille milliards de bactéries !!! Chacun de nous héberge cent mille milliards de bactéries constituant la flore digestive. Stérile avant la naissance, notre tube digestif est rapidement colonisé par cette flore complexe et diversifiée qui se stabilise au cours des premières années de la vie. Les interactions entre lorganisme et la flore digestive participent au maintien en bonne santé, alors que nous associons souvent "bactéries" et "maladie". Les bactéries que nous hébergeons ont un rôle bénéfique en termes de nutrition et de santé.

32 Au niveau de la planète la biomasse microbienne représente plus de la moitié de la biomasse terrestre

33 0,01 0, ,1 Si Mg O Ca Na P N C S H Croûte terrestre Biomasse

34 D'où vient le carbone ? Carbone minéral : CO 2 (bactéries autotrophes : chimiolithotrophes, phototrophes) Carbone organique (bactéries hétérotrophes)

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37 0,01 0, ,1 Si Mg O Ca Na P N C S H Croûte terrestre Biomasse

38 D'où vient l'azote ? Azote atmosphérique N 2 Composés minéraux de l'azote (NH 4 +, NO 2 -, NO 3 - )

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41 Le rôle de l'infiniment petit dans la nature est infiniment grand Louis Pasteur

42 Nos connaissances en microbiologie ont été obtenues à partir de quelques centaines despèces parmi les quelques 5000 espèces répertoriées Moins de 1% des bactéries sont cultivées Le monde microbien reste encore pratiquement inexploré La plupart des contributions du monde microbien à la vie de la biosphère ne sont connues que superficiellement A ce jour

43 De nombreuses raisons de s'intéresser aux communautés bactériennes - impact sur les équilibres biogéochimiques - quels sont les acteurs ? - nouvelles étapes des cycles biologiques des éléments - impact sur la santé (flores microbiennes humaines) - modèles d'écosystèmes (structure des communautés bactériennes) - utilisation de la biodiversité à des fins d'applications - substances thérapeutiques - substances d'intérêt industriel - enzymes utiles pour la chimie de synthèse - bioremédiation - nouveaux éclairages sur l'évolution

44 Comment aborder la question de la composition des communautés bactériennes ? - rDNA 16S - FISH - métagénomique - techniques sur cellules isolées - culture

45 ADN Extraction séquençage Clonage dans E. coli Clones sequences dADN Analyse de séquences Extraction Echantillon de l'environnement La métagénomique

46 Tous les génomes de bactéries possèdent au moins une copie du gène rouge

47 Ce gène rouge présent chez toutes les bactéries est en fait composé - de parties communes retrouvées dans ce gène dans toutes les bactéries - de parties qui sont propres à une seule espèce de bactéries

48 Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des - parties communes (noir) qui sont présentes sur la séquence de ce gène dans toutes les bactéries ceci permet de le retrouver à partir d'un mélange des ADN extraits de bactéries vivant dans un environnement particulier

49 Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des - parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries ceci permet de distinguer ce gène chez une espèce du même gène chez les autres espèces du mélange

50 Ce gène présent chez toutes les bactéries possède des - parties (autres couleurs) qui sont uniques à chaque espèce de bactéries ceci permet aussi savoir quelles espèces connues et inconnues sont dans le mélange et d'avoir une idée du nombre despèces de bactéries qui sont dans le mélange et de leur abondance

51 Résultats : Hybridation in situ sur les boues 10 µm Floc du bassin aérobie (BA) photo CLSM (gross. 630) hybridation avec sonde : - groupe Planctomycetales Pla46F marqué au CY5 - sonde spécifique « nouveau genre » 322R marqué au CY3 - superposition Pla46F et 322R - autofluorescence

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54 Problèmes d'analyses des données d'un métagenome Données très fragmentaires Liens perdus avec les cellules d'origine La grande majorité de ces cellules sont inconnues

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56 Quelques résultats de la métagénomique - reconstitution de la séquence génomique complète de plusieurs bactéries non cultivables - présence d'un grand nombre de gènes de proteorhodopsine dans les bactéries - découverte de dizaines de milliers de gènes de fonction inconnue - association entre type de flore bactérienne intestinale et obésité


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