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LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX HEPATITES VIRALES.

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1 LES TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE APPLIQUEES AUX HEPATITES VIRALES

2 bDNA Plusieurs sondes de détection par cible Ajouter sondes et ADN branché TMA Copies (ARN) Ajouter primers et enzymes 1 sonde de détection par copie Ajouter primers et enzymes PCR Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie amplifiée Cible ARN ou ADN Virus 1° - Les techniques de quantification virale Détection en point final Détection en temps réel

3 TMA: Avantages et inconvénients Avantages: Amplification dADN ou dARN Permet lamplification simultanée de plusieurs cibles Production damplicons ARN Réalisée dans un tube unique Jusquà 100 résultats obtenus en 4 heures Inconvénients: Technique en grande partie manuelle sensibilité / contaminations

4 bDNA Pré-amplificateur* Microplaque ARN cible Label Extender* (LE) Capture Extender (CE) Sonde de Capture Sondes* marquées hybridées à lAmplificateur* Versant HCV-RNA (bDNA3.0)

5 3UT5UT C E1 E2/NS NS2NS3NS4NS5 StructuralNon-Structural HCV RNA Spacer (SP) Capture Extender (CE) Label Extender (LE) 17 sondes de capture permettant une quantification Équivalente de tous les génotypes Versant HCV-RNA (bDNA3.0) bDNA

6 Caractéristiques Versant HCV RNA bDNA 5 Standards Gamme détalonnage externe Phage recombinant Contrôles 1 Positif Fort 1 Positif faible 1 Négatif (simple) Linéarité – copies/ml 615 – 7, UI/ml Type Échantillon Plasma ou sérum Volume échantillon 50 µl Instrumentation Système 340 ou 440 bDNA

7 Technique automatisée Excellente reproductibilité Permet la quantification de lARN VHC avec une bonne linéarité prise dessai faible : 50 μl Inconvénients bDNA Avantages 84 résultats peuvent être rendus après 2 demi-journées sur 2 jours de manipulation séries minimum de 24 échantillons Sensibilité relativement faible : seuil de détection à 615 UI/l

8 PCR en point final Amplicor Roche ou LCx Abbott Détection colorimétrique ou fluorimétrique en point final

9 PCR en point final Amplicor HCV 2.0 Roche –Linéarité :600 à UI/ml –Sensibilité 50 UI/ml en qualitatif, 600 en Monitor Abbott LCx –Linéarité jusquà 23 millions IU/ml –Sensibilité 23 UI/ml Hépatite C

10

11 PCR en temps réel

12 Gamme de linéarité PCR en temps réel

13 Ct Log C 0 Droite standard 10 8 copies 10 copies PCR en temps réel

14 SYBR ® Green TaqMan ® Sondes dhybridation MGB TaqMan ® Molecular beacon, Scorpions... PCR en temps réel Principaux types de fluorophores

15 PCR en temps réel Principe du FRET : Fluorescence resonance Energy Transfert Transfert dénergie sans transfert de photons (non radiatif) λ dexcitation

16 quencher reporter PCR en temps réel Technologie TaqMan®

17 PCR en temps réel Technologie FRET par sondes spécifiques

18 Cobas TaqMan 48 CTM 48 et AL 3.1 station de pilotage Extraction automatisée cobas AmpliPrep Abbott Real Time Extraction Chargement des tubes primaires Préparation de la réaction de PCR Amplification et Détection 3h 15mn 1h30

19 Acides nucléiques totaux ARN et ADN Technologie de capture sur billes de silice Lyse, stabilisation et déprotéinisation Capture Casse des Virus et des cellules Libération des acides nucléiques Virus ou Cellule Cible ADN ou Cible ARN (Virus) Fixation des Acides nucléiques sur la silice à la surface des Magnetic Particle (Billes) Particle Magnetic (Billes) coatées à la silice 37°C Libération des acides Nucléiques à partir des billes Elution 80°C Lavage TA

20 Une grande sensibilité Une gamme très étendue de linéarité Détection simultanée de plusieurs cibles (standard interne de quantification) Possibilité de Multiplex PCR en temps réel Les avantages Inconvénients Prise dessai importante denviron 1ml Appareillage spécifique

21 Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV CAP/CTM TaqMan HCV : Linéarité : 43 UI/ml à 69 millions UI/ml Sensibilité : 15 UI/ml Spécificité : 99,99% Génotype : 1 à 6 ? : sous-estimation des génotypes 4 Abbott Real Time HCV ART HCV : Linéarité : 12 UI/ml à 50 millions UI/ml Sensibilité : 12 UI/ml Spécificité : >99% Génotype : 1 à 6 : pas de dépendance au génotype PCR en temps réel Lhépatite C

22 CAP/CTM TaqMan HBV: Linéarité : millions UI/ml Sensibilité : 12 UI/ml Spécificité : 99,50% Génotype : A à G, mutants pré-core Roche Cobas AmpliPrep/ TaqMan 48 HCV ART HBV : Linéarité : 1.16 log c/ml à 9.16 log c/ml Sensibilité : 10 UI/ml Spécificité : 100% Génotype : A, B, C, D, E, F, G et H détectés Abbott Real Time HCV PCR en temps réel Lhépatite B

23 2° - Les techniques de détection des génotypes et des mutants Chromogène (NBT/BCIP) Précipité Violet Cible ARN ou ADN Virus LIPA SEQUENCAGE

24 Chromogène (NBT/BCIP) Précipité Violet VERSANT HCV LiPA 2.0

25

26 Extension du menu de génotypage –GT 1à 6 c-l 5NCR GT 1-6 Core GT 1a/1b et GT 6 c-l Amélioration du soustypage –Meilleure Spécificité entre 1a et 1b Nouveau design des bandelettes Toujours 1 bandelette /1 résultat Marqué CE Une boite damplification comprenant tous les réactifs nécessaires Plusieurs méthodes dextraction testées et validées

27 TRUGENE HCV 5NC Autres protocoles Amplicor HCV Monitor - Purification CLIP Sequencing / TRUGENE TM HCV 5 NC Long-Read Tower GeneObjects Gene Objects / GeneLibrarian Rapport de génotypage TRUGENE TM HCV 5 NC (Type/Soustype/Isolat/accession number) Détection du séquençage Analyse de séquence Preparation échantillons Réaction de séquençage 3h 0h 5 NC Amplicon

28 TRUGENE HCV 5NC

29 Génotypage HCV LIPA –Possibilité de grandes séries avec détection automatisable –Détection des doubles populations –Lipa 1 sur amplicons Roche mais –Lipa 1 : mauvaise discrimination des sous- types 1, pas de 6 –Lipa 2 : mise en œuvre nécessitant une amplification spécifique TRUGENE –++ pour épidémiologie (comparaison de souches) –Meilleure discrimination des sous-types mais –Petites séries uniquement –Difficulté de mee de doubles populations Avantages et inconvénients des deux techniques

30 Mutants HBV : rappels Génome du virus B Mutants précore : Sur le gène précore mutation stop entraînant larrêt de la synthèse de lAg Hbe Sur le BCP (binding core promoter) qui agit sur la régulation du gène core Mutants YMDD : Sur le gène de la polymérase, site daction des analogues nucléosidiques (lamivudine)

31 Mutants précore : –Lien avec lévolution de la maladie ? –Lien avec la réponse au traitement ? Mutants de la polymérase : –Adaptation du ou des traitements : Apparition quasi systématique en cas de tt prolongé à la lamivudine seule Certaines mutations pourraient compromettre les traitements ultérieurs par dautres molécules Arrêt du tt (sans risque) ou changement de molécule Mutants HBV : rappels Interêt de leur détection

32 Même technologie que pour lHCV Intérêt clinique : différences de pronostic dévolution spontanée et sous traitement des génotypes : –Occident : A > D (plus sensible à linterféron) (Erhardt et al, Gut,2005, 54 : ) –Asie : B >C (moins dactivité inflammatoire et dévolution vers la cirrhose; meilleure réponse au tt) TRUGENE HBV GENOTYPING

33 TRUGENE TM HBV assay preS1 preS2 RNase H TP HBsAg SPACER RT F A B C D E ~500pb SA Mutations* 145R RT Mutations** 173L 180M/V 204I/V (YMDD) 207I 236T*** I169T, M250V**** T184S/A and S202G**** *Carman et al The Lancet, 336, ** Pillay et al International Antiviral News, 6:9 ***Angus et al Gastroenterology, 125, ****Colonno et al, 2005 EASL, Abstract 478 Lamivudine Adefovir Entecavir

34 TRUGENE HBV Analyse des séquences GeneObjects / GeneLibrarian TRUGENE HBV Report Préparation de léchantillon Extraction de lADN génomique Qiagen Blood DNA Extraction Kit PCR Réaction PCR 1.2 kb fragment Mutations Genotype (A to G) Réaction de séquençage Sequencing Reaction CLIP sequencing (520 pb) Détection des séquences Long-Read Tower GeneObjects GO 3.2

35 GeneLibrarian HBV Module: Genotyping report (1): Genotype séquence consensus la plus proche HBV genotype

36 List of Mutations in SA and Pol (RT) - Published substitutions - Silent mutations (all positions) - Substitution not at published sites - Unpublished coding changes GeneLibrarian HBV Module: Genotyping report (2) : Mutation Profile

37 DETECTION DES MUTANTS HBV technique LIPA par Innogenetics Mutants précoreMutants YMDD

38 LIPA Manuel, facile à mettre en oeuvre, pas dappareillage Non OUI OUI Non TRUGENE HBV automatisé, facile à interpréter, standardisé OUI OUI Format Genotype viral (A-G) Mutations RT Mutations Ag HBs Nouvelles Mutations sur RT & SA Mutants et génotypes HBV Comparaison des deux techniques

39

40 Remerciements à Catherine Lemagne, société Bayer Nicolas Gautier, société Roche Christine Murigneux, société Abbott pour laide apportée dans liconographie


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