La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

La présentation est en train de télécharger. S'il vous plaît, attendez

UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D ETUDE DU GENOME.

Présentations similaires


Présentation au sujet: "UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D ETUDE DU GENOME."— Transcription de la présentation:

1 UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D ETUDE DU GENOME

2 I- STRUCTURE DU GENOME Organisation Composition Les différentes séquences Le gène

3 INTRODUCTION Ensemble du matériel génétique dun organisme Il est constitué dADN pour la majorité des organismes Certains virus ont un génome constitué dARN La taille du génome varie en fonction des espèces

4 ORGANISATION Chez la majorité des bactéries ( procaryotes) le génome est contenu dans UN seul chromosome circulaire Le génome peut être linéaire (actinomycètes) Chez les eucaryotes : ADN nucléaire, ADN mitochondrial

5 DENSITE DES GENOMES Chez E.Coli, le génome est composé presque exclusivement de gènes 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb Chez lHomme 3200 Mégabases / Gènes / 8 / MGB La quasi-totalité génome bactérien est codant !

6 Espèce Humaine Génome nucléaire: 3, pb pour n chromosomes et répartis dans 22 autosomes + 2 chromosomes sexuels Génome mitochondrial : pb, épisome Aucune corrélation entre la taille du génome et la complexité des organismes Plus grands génomes : > pb : pins, plantes

7 COMPOSITION DU GENOME HUMAIN Des gènes : environ composés de séquences codantes ( exons) et non codantes (les introns, séquences régulatrices; promoteur, silencer, enhancer …) régions codantes : 1.5% du génome ; introns 25%, région régulatrices: 5% Des Pseudogènes 1.5% De très nombreuses séquences répétèes 60% Autres régions non codantes : séquences uniques ou très peu répétées 7%

8 Séquences répétées Répétées en Tandem minisatellites : des séquences de 10 à 25 pb sont répétées un grand nombre de fois minisatellites ( empreintes génétiques) microsatellites : 1à 5 pb répétées x fois sur plusieurs kb microsatellites ADN satellite : centromères, télomères ( 10% du génome humain)

9 Microsatellites Dispersés sur tout le génome 1 à 5 nucléotides Copies A(n) / T(n) 10 7 (CG)n / (CA)n/ (GT)n (CT)n / (GA)n 3 x 10 6 Les plus étudiés (CG; CA)n CGCGCGCG TANDEM CGn = 23n = 15n = 20

10 Séquences répétées dispersées Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu) Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases ( copies) Les transposons ( copies)

11 Séquences répétés dispersées SINEs : Famille ALU Copies : ALU 10 4 pb pb Famille Kpn (L1) 1300 pb copies Peuvent être transcrites

12 Séquences SINEs ALU REPEAT (AAA)n AT RICH GC RICH (AAA)n

13 Eléments transposables IS éléments 2600 – 700 pb 5' 3' CTGACTT 3' 5' TTCAGTC Répétition aux extrêmités (Maïs)

14 G è ne S é quence d'acides nucl é iques contenant une information cod é e, transmissible, pour la production r é gul é e d'un ARN (transcription), ce dernier pouvant être traduit en une cha î ne polypeptique Certains g è nes codent seulement des ARN sans traduction en protéine

15 Les gènes des rétrovirus sont constitués d'ARN

16 Pseudogènes Séquences partiellement homologues aux gènes qui ne donnent jamais de protéines correspondantes Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté Soit des ARN retro-transcrit ADN intégration ADN génomique ( transposition)

17 ANATOMIE DU GENE globine

18 Exon III Exon II IVS 2 IVS pb Gène globine Zone des promoteurs 5' UTR 3' UTR Exon I

19 R é gion r é gulatrice en 5' Zone des promoteurs CAP CACCC CCAATTATA A/T A A/T G CCCCC AGAG Facteurs de transcription Site d'initiation de la transcription

20 Région 5' non Traduite 5' UTR Région 5' UTR - Attachement aux ribosomes - Régulation transcription +/ CACCATG 0 CTTCTG +50 Codon initiateur CAP

21 Exon Partie codante d'un g è ne prot é ine Exon 1 ATG IVS1 Exons Traduction protéine 30

22 IVS1 130 pb Exon 2 GT Donneur de l'épissage AG Accepteur de l'épissage Zone non traduite

23 AAAAAA AATAAA Nucléotides STOP 146 AATAAA : Signal de polyadénylation : Clivage de l'ARN après transcription (AAAAA)n : Stabilise l'ARN ( ajouté après la transcription) Région 3' UTR Codon 147

24 II ETUDE DU GENOME A- Les expériences fondamentales qui ont révélé l existence de lADN comme Génome L Etude du génome complet dun individu est très récente et découle du séquençage dun génome entier ( début XXI)

25 Cest lanalyse de lADN Elle était indirecte avant linvention des techniques du séquençage (1977) Elle utilisait létude des protéines qui renseignaient indirectement sur les gènes Des mutants de bactéries, de drosophiles

26 Origines de létude du Génome Dès le XIX siècle : létude de la transmission des caractères sur des critères danalyses qualitatives et statistiques ( Lois de Mendel 1860) Mise en évidence de l ADN (1865) Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile) critères danalyses qualitatives et statistiques Puis des techniques bactériologiques et biochimiques ont permis de franchir une étape dans le degré dinvestigation de létude des génomes ( ) Structure ADN (1953 )

27 Expérience de Griffith (1928) Bactérie : Diplococcus pneumoniae 2 souches S = capsule polysaccharidique > infectieux R = dépourvue de capsule > non infectieux

28 Des lots de souris Groupe1 : Injection souche S à des souris > pneumonie Groupe 2 : Injection souche R > pas dinfection Groupe 3 : Injection dune souche R + souche S préalablement tuée par la chaleur => pneumonie

29 RESULTAT Le sang des souris du groupe 3 est mis en culture : on recueille soit des souches R soit des souches S virulentes... Lexpérience fût refaite en 1944 avec la conclusion que lADN était le matériel héréditaire

30 Avery, Mac Leod, Mac Carthy Interprétation : Les souches S tuées sont capables dinduire une transformation des bactéries R en bactéries S Quelle est la nature de ce matériel transmissible ? En ajoutant l ADN purifié des souches S à des colonies de type R les colonies R > S Les autres fractions (polysaccharides,protéines) nont pas de pouvoir transformant...

31 Lorsque lADN des souches S est traité par la DNAse avant dêtre ajouté aux bactéries de souche R > pas de bactérie de type S La transformation des souches R en souche S est la conséquence dun transfert dADN LADN est donc le matériel génétique

32

33 De 1944 à 1952 une partie de la communauté scientifique nétait toujours pas convaincue par cette conclusion et lhypothèse que les protéines étaient le matériel héréditaire était encore défendue

34 Colette VENDRELY ( professeur dembryologie à Amiens ) & R. VENDRELY démontrent en 1949 que la quantité dADN présente dans les gamètes est la moitié de celle contenue dans les cellules somatiques. Ce résultat est le seul travail français internationalement cité comme contribution majeure à la preuve de lADN comme matériel héréditaire

35 UN pas décisif vers la découverte de la structure de l ADN En 1950 Erwin Chargaff découvre que l'adénine et la thymine existent en quantités égales, et qu'il en est de même de la guanine et de la cytosine, d'où la célèbre équation % A = % T % G = % C

36 Expérience Hershey & Chase 1952, ils démontrent en utilisant le phage T2 traité au tritium * (acides nucléiques radio- actifs) que les ADNs répliqués sont radioactifs. Les protéines ne sont pas radioactives donc ne se répliquent pas …

37 Découverte de la structure de lADN 1953

38

39 Découverte de la structure de lADN

40

41 It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material. « Il n a pas échappé à notre attention que la les appariements spécifiques que nous proposons suppose immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique » Le modèle de réplication semi-conservatif sera prouvé en 1958 par Meselson et Stalh

42 Le modèle semi conservatif de la réplication Le bon modèle pour 3 possibilités

43 modèle conservatif A partir d'une molécule d'ADN bicaténaire "mère", on forme une nouvelle molécule d'ADN bicaténaire. On garde donc ici une molécule "mère", non modifiée (elle est donc conservée), tout en "créant" une nouvelle molécule ("fille").

44 On ne conserve aucun brin intact. La copie se réalise par fragments dispersés dans l'ensemble de l'ADN, permettant de former les deux molécules d'ADN bicaténaires "filles".

45 Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN bicaténaire "mère". Chaque brin sert donc de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, l'ensemble reformant une molécule d'ADN bicaténaire. Chaque nouvelle molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule mère

46 Dans le tube 0 la totalité de lADN est marqué à l azote 15 ( les 2 brins). Après une réplication la moitié de lADN est radio actif. Au fur et à mesure des réplications la quantité dADN marqué diminue lADN au profit dabord d ADN hybride, puis dADN froid.

47 Le résultat observé après séparation des ADNs répliqué correspond au modèle semi conservatif

48 Propriétés physico-chimiques Déroulement de tout l ADN dune cellule dun individu : 1.6 Mètre Déroulement de lADN de toutes les cellules dun individu : diamètre du système solaire! ADN cellulaire : 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)

49 Quelques valeurs … Pb = Masse Moléculaire = 2x330 g x /6, moles de nucléotides > = 6, g dADN Il y a environ 6 picogrammes dADN dans une cellule diploide 1 µg dADN génomique -> g / g/cellule >> 10 7 cellules diploides

50 II ETUDE DU GENOME B) LES OUTILS

51 B- 1- PURIFICATION DE l ADN Méthode au Phénol / Chloroforme Purification des cellules Lyse des cellules ( SDS, Lysozyme) Action protéinase K, Rnase Extraction au phénol Action du CHCl3 Précipitation dans léthanol en milieu salin Re-suspension en présence de tampon TRIS - EDTA ( 1 mM) ( 100 microG / microl)

52

53

54 B-2 Les Enzymes de Restriction Sont des ciseaux moléculaires qui hydrolysent lADN; Ils reconnaissent des séquences palindromiques (Ex RADAR) Ils permettent de mette en évidence des variations de séquence ( polymorphismes, mutations) Ils sont utilisés en génie génétique ( clonage) En diagnostic de routine en génétique médicale

55 Des enzymes de Restriction

56 5'-G*GATCC-3' Bam HI 3'-CCTAG* G-5 5 '-G -3' --- 5'- GATCC-3' 3'-CCTAG-5' ----> 3'- G-5'

57

58 B-3 L Hybridation et les sondes Hybridation par complémentarité de séquence et appariement des bases Sonde : petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée par un composé fluorescent, ou radioactif Les sondes doivent être spécifiques dune séquence et très sensibles. Utilisation diagnostique

59

60 RapideLent Taux de Renaturation SIMPLEBRIN%SIMPLEBRIN% Cot (mole sec.l -1 ) ADN hautement répétitif ADN moyennement répétitif ADN peu répétitif Copies uniques

61 B-4 Application sondes et ER : "POLYMORPHISME" Plusieurs Formes Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle soit ponctuelle ou qu'elle intéresse une répétition de mini / micro satellites est un polymorphisme si sa fréquence est 1 % dans une population donnée à une fréquence < 1 % mutation (privée) Les polymorphismes sont soit : - Neutres - Avantageux - Désavantageux

62 L'ADN n'est pas un élément statique Il est sujet à des modifications transmissibles Les variations de séquence sont appelées polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une fréquence > 0.01 (moins de 1 % : mutations) L'hétérozygotie moyenne de l'ADN humain est d'environ 0,004 (1 base différente toutes les bases entre 2 allèles ou 2 séquences, entre 2 individus) Les Polymorphismes

63 Le polymorphisme affecte toutes les régions de l'ADN - Séquences codantes - Introns - ADN répété (mini, microsat…) Il peut modifier : - 1- Un site de restriction - 2- La longueur d'un motif répété

64 Un polymorphisme peut induire une longueur détectable par enzyme de restriction Microsatellites Minisatellites

65 Les polymorphismes du DNA servent à son analyse

66 RFLP Un RFLP est défini par un couple : Sonde / Enzyme (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Sa localisation précise, sa variabilité et sa transmission mendélienne lui confèrent un caractère de marqueur génétique codominant. Le couple sonde / enzyme se caractérise par : + / - et correspond à un bi-allélisme Les RFLPs sont mis en évidence par la méthode de Southern ou PCR Pour être informatif : le RFLP doit être reconnu par une sonde unique

67 On distingue des sites de restriction obligatoires (toujours présents) et des sites de restriction variables Polymorphisme Mst II Chez un individu sur 100 on découvre 20Kb

68 Exemple EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse 5' GAATTC 3' 3' CTTAAG 5' Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne peut plus hydrolyser l'ADN à cet endroit. AB GAGTTC CTCAAG (A + B)

69 Marqueur Eco RI+ Gène Position non connue avec précision Eco R1- M Gène muté maladie Ces fragments peuvent être différencier par leur taille 5kb 4kb

70 Polymorphisme de Répétition EcoRI 200 pb EcoRI 300 pb sonde A/BA/AB/B (CA)n + 2(CA)n Allèle A Allèle B

71 III- LES TECHNQIUES A - La méthode PCR Polymerase chain reaction

72 Avantage de la Technique Elle permet détudier un segment d ADN au sein de tout le génome si lon connaît sa séquence Elle permet de recopier ce segment (amplification des millions de fois et de le visualiser par une méthode électrophorétique Par coloration au bromure déthidium ou autre colorant Ce segment peut être par la suite traité pour mettre en évidence une mutation Pour le cloner

73 Principe Succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN. Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre. Les amorces ou «primers» en anglais définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier. Les amorces sont orientées dans le sens 5 vers 3

74 Chaque produit de chaque étape de synthèse sert de matrices pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle. Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel de Chimie dès 1993), la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique en supportant les sauts de température

75 On opère avec des sauts de température à chaque étape EN effet, une température dite dannealing permet lhybridation de lamorce avec lADN ( 56°) A une autre température, cest l élongation ou extension ( 72 ° C) A une dernière température les brins amplifiés sont séparés : température de dénaturation ( 94°c )

76

77 lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm Ou Principe de la PCR > ( google) lyon.fr/RELIE/PCR/principe/principe.htm

78 On peut ainsi amplifier assez facilement une région couvrant 2000 pb Des amplifications de morceaux plus longs sont possibles mais plus délicates ( pb)

79

80 B- GAP-PCR / Application de la méthode PCR au diagnostic de grandes délétions Les délétions mises en évidence par la méthode PCR Des amorces choisies pour être très éloignées lune de lautre lorsquil nexiste pas de délétion, ne permettront pas un amplification En cas de délétion, les amorces sont rapprochées et lADN amplifié signe alors une délétion. Dodé C, Krishnamoorthy R, Lamb J, Rochette J. Br J Haematol.1993 Jan;83(1):105-11

81 Distance entre A4 et A9 = 1800 pb : si les gènes alpha 1 et alpha 2 sont présents la Région amplifiée est de 194pb entre A4 et A1B. Si,les deux gènes sont délétés la distance entre A4 et A9 est raccourcie et lamplification révèle un fragment de 550pb.

82 C- LA PCR INVERSE ou Reverse Transcriptase PCR ( RT-PCR) La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR On isole des ARN m par purification spécifique de de ces derniers Ils sont ensuite « recopiés » en ADN par une enzyme : la transcriptase reverse On réalise une PCR comme précédemment Le produit final est un ADN dont l'un des brins est complémentaire de l'ARN d'intérêt et l'autre brin a la même séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution près de U par T).

83

84 Difficultés Techniques La contamination des échantillons par de l'ADN génomique est une des principales difficulté de cette technique. En effet, l'ADN génomique peut entrer en compétition avec l'ADNc pour lors de l'étape d'hybridation des amorces. Diverses parades sont alors utilisées :

85 Parades 1 Des ARNm eucaryotes polyadénylés peuvent être purifiés par chromatographie de l'ARN cellulaire total sur une colonne où sont immobilisés des oligo-dT (oligonucléotides constitués de désoxythymidines).

86 2 Les ADN présents dans l'échantillon peuvent être détruits par ajout d'une activité désoxyribonucléase (dépourvue d'activité ribonucléase).

87 3 Choisir les amorces aux bornes d'un intron. Ainsi, les produits d'amplification issus de l'ADNc et ceux issus d'ADN génomique contaminant seront distingués selon leur taille : les fragments issus de l'ADN génomique (contenant l'intron) auront une taille supérieure aux fragments d'amplification issus de l'ADNc (ne contenant pas l'intron).

88 D- MUTAGENESE DIRIGEE Réalisation dune amorce mutée l'extrémité 3' doit rester complémentaire de la séquence de matrice à amplifier (initiation de la polymérisation) l'extrémité 5' qui peut porter de nombreuses modifications : des mutations ponctuelles, des sites de restriction, des séquences de recombinaison etc.

89

90 Mutation à des extrémités

91

92 Principe Les amorces 1 et 2 sont des amorces mutées (la région 5' qui porte la mutation est symbolisée par un rectangle rouge). Obtenues par synthèse chimique. Ces amorces sont complémentaires (le recouvrement des régions 5' mutées en rouge est particulièrement important pour la suite). Les amorces 3 et 4 bornent le segment d'ADN à modifier. Elles détermineront la longueur du produit final.amorces mutées

93 Deux réactions de PCR sont effectuées en parallèle : Une PCR avec les amorces 2 et 3 donne un produit d'amplification correctement muté dans la région désirée, mais de petite taille

94

95 Une PCR avec les amorces 1 et 4 donne aussi un produit muté, mais toujours de taille insuffisante.

96 Les deux produits de PCR sont purifiés, il s'agit surtout d'éliminer les amorces 1 et 2 On regroupe dans le même tube tous les produits PCR

97 Ils possèdent en commun la région mutée (région d'ADN possédant un rectangle rouge). L'hybridation de ces deux fragments par cette partie commune est critique pour la dernière étape.

98 Une dernière PCR utilisant les amorces 3 et 4 est alors réalisée sur ce mélange et donne, en effet, un fragment de la taille souhaitée contenant la mutation.

99

100 IV LE SEQUENCAGE ADN ARN

101 Séquençage de lADN. F SANGER (1977)

102 Séquençage de lADN :Walter GILBERT

103 LE SEQUENCAGE PAR LA METHODE DE SANGER On copie le brin à séquencer de telle sorte que les copies soient radioactives (ou repérables par un autre marquage : fluorescence ) Soit la séquence suivante à déterminer : 3 …… G C A T G A T C G G 5 ……Amorce présentera une extrémité 3 OH libre Il faut choisir une amorce complémentaire dun bout de séquence connue

104

105 La DNA polymérase réplique 5' 3' à partir 3'OH libre de lamorce en présence d'un 2, 3 didéoxynucléotide la réplication est stoppée. Statistiquement on observera des fragments d'ADN de tailles différentes en fonction de l'incorporation du 2, 3 didéoxynucléotide pendant la réplication du brin à séquencer

106 Tube 1 4dNTP, ddGTP 3' GCATGATCGG CG # CGTACTAG # Tube 2 4dNTP, ddATP 3'GCATGATCGG CGTA # CGTACTA #

107 Tube 3 4dNTP, ddCTP 3' GCATGATCGG 5' ddC # CGTAC # CGTACTAGC # CGTACTAGCC # Tube 4 4dNTP, ddTTP 3' GCATGATCGG 5' CGT # CGTACT #

108 Tube 1 : ddGTP 1er fragment : 2 bases 2 nd fragment : 8 bases Tube 2 : ddATP 1er fragment : 4 bases 2 nd fragment : 7 bases Tube 3 : ddCTP 1er fragment : 1 base 2 nd fragment : 5 bases 3 ème fragment : 9 bases 4 ème fragment : 10 bases Tube 4 : ddTTP 1er fragment : 3 bases 2 nd fragment : 6 bases

109 Remarques : Il n'y a jamais deux fois la même taille quelque soit le tube examiné Les produits sont radioactifs, ils vont être repérés par autoradiographie après électrophorèse en gel d'acrylamide. Les fragments migreront d'autant plus vite que leur masse moléculaire est faible. La lecture se fera de 5 vers 3 en commençant par les fragments les plus petits ( du bas vers le haut)

110 On lit donc Lecture : 5' CGTACTAGCC 3' Séquence : 3' GCATGATCGG 5 On donne le produit complémentaire du produit de lecture : 3 …… G C A T G A T C G G 5

111

112 Sanger Centre-Cambridge

113 Sequençage direct de lARN ON ne transforme pas en cDNA Des séquences de poly T sont bloquées sur un support Le support capture les ARN par leur extrémité poly A 3dA : 3 Desoxy A bloque la fin de séquence dARN Il sont ensuite complétés avec addition de Thymidine non marquée Puis bloqués avec des nucléotides fluorescents A et C et G, dit terminateurs + Polymérase. Cette méthode permet le début dune lecture par fluorescence là où commence le RNA et ne lit pas le poly A.

114

115

116 V- ANALYSE DE lADN Par les méthodes de séparation de fragments

117 La Séparation des fragments dacides nucléiques V-A Techniques Electrophorétiques Les macromolécules chargées électriquement peuvent migrer dans un champ électrique. La densité de charge par unité de longueur est la même dans lARN et lADN (contrairement aux protéines). La migration seffectue du Pôle - vers le Pôle + du générateur. La différence de migration se fera donc par la taille Le support de migration ( acrylamide, agarose) jouant un rôle de filtre, les fragments les plus petits migreront plus rapidement que dautres plus longs dans le dispositif classique.

118

119 Coloration au Bromure déthidium sous lampe UV

120 La migration seffectue du haut vers bas. Les fragments les plus petits sont en bas du gel de migration

121

122 Électrophorèse dADN humain sans hydrolyse par ER : Smear

123 V-B LA METHODE DE SOUTHERN einte/southernblot.html einte/southernblot.html

124 1) Extraction de l'ADN des différents génotypes à analyser 2) Digestion de l'ADN par un enzyme de restriction. On obtient alors des fragments d'ADN de longueurs différentes selon les individus. Cette différence de taille est due a une différence du nombre de site de restriction qui varie selon les individus. l'ADN à analyser est fragmenté en séquences plus ou moins longues en fonction du polymorphisme de longueur des fragments de restriction. SOUTHERN BLOT

125 3) Ces fragments de restriction sont séparés selon leur taille par une électrophorèse en gel d'agarose. L'ADN étant chargé négativement, il migre de la cathode vers l'anode. Les fragments les plus petits sont les plus rapides.électrophorèse 4) LE BLOT / L'ADN est ensuite transféré sous forme dénaturée ( NAOH, KOH, 1M) sur une membrane de nylon. La position relative des fragments d'ADN est préservée durant le transfert.

126 5 ) L HYBRIDATION : La membrane est incubée dans une solution contenant une sonde marquée préalablement, soit par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie. On utilise couramment deux types de sondes : les sondes génomiques (ADNg) et les sondes d'ADN complémentaire (ADNc).

127 Les sondes génomiques sont obtenues par digestion de l'ADN total du génome nucléaire de l'espèce étudiée à l'aide d'un enzyme de restriction. Les sondes d'ADNc correspondent nécessairement à des gènes exprimés, puisqu'elles sont obtenues à partir des ARN messagers.

128 6) L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est fixée sont révélés en plaçant la membrane au contact d'un film sensible à la radioactivité (figure), ou en réalisant une réaction enzymatique colorée spécifique..

129 4kb 2Kb 4.2Kb

130 Interprétation des résultats considérant 2 allèles Sonde Sites Eco R1 4Kb2Kb Site polymorphe sur le 2 ième allèle : 4.2kb

131 Interprétation du résultat Des individus sont 4/2 // 4/ 2 (homozygotes) Des Individus ne montrent aucune hybridation -- Délétion dau moins 6 kb (homozygote) Le dernier : 4/2 // 4.2/2 : ses deux allèles sont différents ( hétérozygote)

132

133 Diagnostic de la drépanocytose Maladie génétique fréquente en Afrique noire au Moyen Orient et en Inde. Maladie récessive Mutation ponctuelle par substitution Glu > Val sur le gène beta globine ( codon 6) GAG > GTG Cette mutation supprime un site de restriction pour lenzyme Mst II

134

135

136 LE NORTHERN BLOT // Southern BLOT Isolement de lARN colonne oligo dT Electrophorèse sans dénaturation, sans hydrolyse Hybridation avec une sonde monobrin

137 LA GENOMIQUE Science des Génomes La génomique regroupe un ensemble d'analyses qui vont : - dune cartographie physique de lADN - d une cartographie des ARN messagers - à l'identification de gènes, de polymorphismes et de séquences dintérêts - à l'étude de leurs fonctions

138 Parler de brin sens ou antisens sur l'ADN n'a de sens (humour) que si nous nous plaçons dans le contexte de la transcription. Le brin sens est celui qui a la même séquence nucléotidique que l'ARN messager transcrit (T / U mis a part bien sûr). Le brin antisens sert de matrice à la polymerase. L'ARN est polymerisé de 5' vers 3'. La matrice (brin "antisens") peut donc être représenté du 3' au 5' Le brin complémentaire (brin "sens") est donc représenté du 5' au 3'. sens 5 -ATTTGCTGCCTT... TGC-3' antisens 3'-TAAACGACGGAA.. ACG-5' RNA messager : 5'-AUUUGCUGCCUU..UGC-3 La lecture dune séquence par la méthode de Sanger lit (en commençant par la talile la plus petite ) de 5 vers 3 cest à dire le brin sens

139 Cartographie de lexpression des GENES Hybridation de lARN sur puces à ADN

140 On construit des supports ou chip-arrays. 6.5 millions de brin sur chaque chip Des Millions de brins de DNA gréffés et accessibles Brins = 25 base pairs Chaque grille est un carré de 11 micromètres porteur de séquences d ADN (oligoprobe ( complémentaire à celle de séquences de gènes) Analyse totale du génome par utilisation de lexpression différentielle des gènes

141

142 RNA (purple) has bound to its DNA probe built on the array RNA Fluorescent Stain Biotin After staining, RNA (purple) bound to the DNA probe built on the array will fluoresce Chaque espèce dARN va hybrider avec la sonde dADN correspondante sur la puce préalablment chargée de sondes dADN. La combinaison ARN biotinylé – ADN est fluorescente et donc repérable par un système de lecture approprié


Télécharger ppt "UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D ETUDE DU GENOME."

Présentations similaires


Annonces Google