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ENZYMOLOGIE (PACES) Pr S. Kamel Faculté de pharmacie Amiens Biologiste CHU Amiens.

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1 ENZYMOLOGIE (PACES) Pr S. Kamel Faculté de pharmacie Amiens Biologiste CHU Amiens

2 I - INTRODUCTION 3 caractéristiques pour une réaction chimique dans la matière vivante : Rapidité Température peu élevée Spécificité CATALYSEURS = PROTEINES = ENZYMES Intérêt fondamental Réactions du métabolisme (régulation ++ : production de métabolites) Pharmacologie moléculaire (inhibiteurs denzymes = médicaments)

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4 Alpha-galactosidase

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6 - Site actif = ensemble d acides aminés (AA) - Interaction substrat + AA (liaisons de faible énergie) Rapprochement ++ des espèces moléculaires Effet de voisinage (différence ++ avec la chimie : pas dagitation moléculaire)

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15 Equation de Michaelis et Menten

16 Km : affinité

17 Km est indépendant de la concentration denzyme

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19 Unité de l'activité enzymatique L'activité enzymatique d'une solution est le nombre de mole de substrat qu'elle dégrade par seconde Katal (Kat) L'unité officielle de la mesure de l'activité enzymatique. C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat par seconde L'unité international (U.I) unité très usuelle C'est la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une mole de substrat par minute 1UI= 16nKat. Dosage La mesure de l'activité enzymatique d'une solution permet de doser une enzyme. Il faut faire la mesure dans des conditions définies de pH, de T°(souvent 37°), de [S], …)

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21 Représentation de Lineweaver et Burk

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24 pH optimal voisin de 7 (enzymes actives à pH acide ou alcalin) mesure de lactivité dune E dans des conditions définies de pH et de T°

25 III- Les Effecteurs dEnzyme Michaeliens 1 – Définition Molécule chimique qui par sa liaison avec lenzyme (ligand) module la vitesse de la réaction enzymatique : - en laccélérant = activateurs (ions divalents Zn ++ ) - en la ralentissant = inhibiteurs (applications pharmacologiques) 2 – Cas de linhibition irréversible E + IE I Liaison covalente

26 - DFIP = gaz neurotoxique - Autre ex : pénicilline (inhibiteur irréversible de la transpeptidase bactérienne)

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29 3-2 Inhibition non compétitive Inhibiteurs non compétitifs analogue structural

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31 3-3 Inhibition uncompétitive (anticompétitive)

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37 Autres exemples dinhibiteurs enzymatiques - Acyclovir : inhibiteur de la thymidine kinase virale - Pénicilline : inhibiteur de la transpeptidase bactérienne - Statines : inhibiteur de lHMG coA réductase = hypocholestérolémiant AcétylCoA AcétoacétylCoA Hydroxyméthylglutaryl CoA (HMG CoA) 2 NADPH2 NADP + 2H + CoA Mévalonate (HMG CoA) réductase Statine (lovostatine) - - Membranes - Acides biliaires - Hormones Stéroides... cholestérol

38 IV – Les enzymes allostériques 1 – Allostérie : définition Ex : Myoglobine et hémoglobine Enzymes Myoglobine (Mb) : - O 2 dans le cytoplasme - 1 chaîne polypeptidique (153 AA) - 1 molécule dhéme Hémoglobine (Hb) :- O 2 dans le sang (GR) - 4 chaînes polypeptidiques (tétramères) 2 et 2ß - 4 molécules dHème (4 O2) Courbe de saturation en O2 de la Mb et de lHb : - Pour Mb : Hyperbole - Pour Hb : Sigmoïdes

39 Interprétation : Mb : 1 chaîne polypeptidique cinétique de saturation michaélienne Hb : 4 chaînes polypeptidiques = oligomère (structure quaternaire) Fixation dune molécule dO2 sur une sous unité entraîne une modification conformationnelle dune autre sous unité qui est alors capable de fixer une autre molécule dO2 : effet de coopérativité positive = protéine allostérique (intérêt physiologique +++)

40 Allostérie : propriété de certaines protéines actives oligomériques (transporteurs, canaux, pompes, enzymes…) de changer de structure spatiale lorsquelles se lient à une molécule de ligand (substrat ou effecteur), cette liaison se traduisant par une modification dactivité. Forme T (tendue) Forme R (relachée) Site actif impropre à la fixation du substrat Site actif permettant la fixation du substrat Transition allostérique

41 2 – La cinétique allostérique

42 3- Modèle dinterprétation 3-1 Modèle concerté de Monod, Wyman et Changeux

43 3-2 Modèle séquentiel de Koshland

44 4 – action des effecteurs allostériques

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46 5 – Régulation des métabolismes in vivo par les enzymes allostériques 5-1 Définitions Métabolisme : ensemble de réactions biochimiques permettant la synthèse ou la dégradation dun métabolite (substrat) Catabolisme : voie métabolique conduisant à la dégradation dun métabolite (glycolyse : dégradation du glucose) Anabolisme : voie métabolique permettant la biosynthèse dun métabolite (glycogenèse : synthèse du glycogène)

47 Biosynthèse de X ou dégradation de A ABCD…. X E1E1 E2E2 E3E3 E4E4 Rétro-inihibition (feedback négatif) E1 = enzyme allostérique X = métabolite terminal = inhibiteur allostérique (régule sa propre biosynthèse)

48 Ex : régulation allostérique de la glycolyse Glucoseglucose 6 PFructose 6 P Fructose 1-6 Bi P Pyruvate production dATP++ PFK Phosphofructokinase Cycle de Krebs Rétro-inhibition AMP + [ATP] glycolyse [ATP] (AMP ) glycolyse

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50 V – Coenzymes et groupes prosthétiques

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55 VI – Applications générales des enzymes 1 - Dosage des activités enzymatiques : intérêt en pathologie humaine - Localisation cellulaire LDH : lactate deshydrogénase CPK : créatine phosphokinase ASAT : aspartate aminotransférase

56 Localisation tissulaire : organospécificité - Créatine phosphokinase (CPK) : muscle squelettique, cœur - Lactate deshydrogénase (LDH) : foie, cœur - Aspartate aminotransférase (ASAT) : foie, cœur - Phopshatase alcaline (PAL) : foie, os, placenta - Gamma glutamyl transférase : foie, rein

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58 - Méthode en point final : transformation totale

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