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Outils chimiques pour létude des macromolécules biologiques Marius Réglier Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service.

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1 Outils chimiques pour létude des macromolécules biologiques Marius Réglier Laboratoire de Bioinorganique Structurale, service 432 Chimie, Biologie et Radicaux Libres UMR-CNRS 6517 Université Paul Cézanne Aix-Marseille III Faculté des Sciences et techniques Avenue Escadrille Normandie-Niemen Marseille cedex 20

2 I. Lapport de la chimie à la biologie moléculaire

3 Le 25 avril 1953, Crick et Watson révèlent la structure de l'ADN Prix Nobel de Medecine en 1962 F. Crick, J. Watson et M. Wilkins Erwin Chargaff Rosalind Franklin

4 Le dogme mRNA tRNA traduction protéine transcription DNA réplication

5 LADN, deux paires de bases AT, CG

6 Triplex

7

8 Quadruplex Télomères

9 T C G A A G C T ADN, deux brins

10 DNA, double hélice

11 Forme B, forme commune dans les conditions physiologiques, faible force ionique et haut dégré dhydratation (10 paires de bases/tour avec une conformation C2'-endo/anti), deux sillons distincs. Forme Z, (Zigzag) riche en paires G-C, allongée et étroite, possède une unusuelle hélice gauche (12 paires de bases/tour), un seul sillon compact Le Zigzag résulte dune alternance de purines (C3'- endo/syn) et de pyrimidines (C2'-endo/anti). Forme A-form, aux fortes concentrations en cations ou aux faibles degrés dhydratation (11 paires de bases/tour, C3'-endo/anti), 2 sillons (1 grand étroit et profond et 1 petit large et peu profond). DNA, polymorphisme

12

13

14 DNA, packaging nucléosomes Chromosome chromatine

15

16 Réplication

17 Transcription et traduction

18 ARN, deux paires de bases AU, CG ADN ARN

19 3 5 U C G A ARN, monobrin

20 ARNt

21 Anti-codon

22 Le code universel 4 3 (64) codons pour 20 amino-acides TTT F Phe TCT S Ser TAT Y Tyr TGT C Cys TTC F Phe TCC S Ser TAC Y Tyr TGC C Cys TTA L Leu TCA S Ser TAA * Ter TGA * Ter TTG L Leu i TCG S Ser TAG * Ter TGG W Trp CTT L Leu CCT P Pro CAT H His CGT R Arg CTC L Leu CCC P Pro CAC H His CGC R Arg CTA L Leu CCA P Pro CAA Q Gln CGA R Arg CTG L Leu i CCG P Pro CAG Q Gln CGG R Arg ATT I Ile ACT T Thr AAT N Asn AGT S Ser ATC I Ile ACC T Thr AAC N Asn AGC S Ser ATA I Ile ACA T Thr AAA K Lys AGA R Arg ATG M Met i ACG T Thr AAG K Lys AGG R Arg GTT V Val GCT A Ala GAT D Asp GGT G Gly GTC V Val GCC A Ala GAC D Asp GGC G Gly GTA V Val GCA A Ala GAA E Glu GGA G Gly GTG V Val GCG A Ala GAG E Glu GGG G Gly

23 Polymerase Chain Reaction (PCR)

24 5 ---AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA ACGTAA AACGTC dNTP + TaqPol 5 ---AACGTC TGCATT ACGTAA AACGTC TTGCAG ACGTAA ACGTAA AACGTC-- 3 dNTP + TaqPol

25 Polymerase Chain Reaction (PCR) 30 cycles permettent damplifier 2 brins dADN en exemplaires AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT ACGTAA AACGTC TGCATT ACGTAA AACGTC TTGCAG ACGTAA AACGTC TTGCAG ACGTAA AACGTC TGCATT TTGCAG ACGTAA ACGTAA AACGTC-- 3 dNTP + TaqPol

26 Plasmide

27 Enzyme de restriction (EcoRI) CAATTG

28 I.1. Synthèse des oligonucléotides

29 Synthèse des oligonucléotides en phase supportée la synthèse chimique des oligonucléotides se fait de 3' vers 5'.

30 Les dérivés phosphoramidites des 4 nucléotides

31 Etape 1: de-blocking

32 Etape 2: Condensation

33 Etape 3: Capping

34 Capping -----ATGCTACGTCAACTA ATGCTACGTCAACT -----ATGCTACGTCAAC -----ATGCTACGTCAA -----ATGCTACGTCA -----ATGCTACGTC -----ATGCTACGT -----ATGCTACG -----ATGCTAC -----ATGCTA -----ATGCTACG -----ATGCTAG -----ATGCTAC -----ATGCTACGT -----ATGCTAGT -----ATGCTACT -----ATGCTAG Sans Avec

35 Etape 4: Oxydation

36 Etape finale

37 Synthétiseur

38 I.2. Séquençage de lADN

39

40 La méthode de Maxam and Gilbert ATGCTACGTCAACTA TACGATGCAGTTGAT Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P ATGCTACGTCAACTA TACGATGCAGTTGAT )Enzyme de restriction (EcoRI) 2)Introduction dans un plasmide

41 La méthode de Maxam and Gilbert Tube 2 + Me 2 SO M HCl 3---TACGATGCAGTTG 3---TACGATGCAGTT 3---TACGATGCA 3---TACGATGC 3---TACGAT 3---TACG 3---TAC 3---T A + G Tube 1 + Me 2 SO M NaOH 3---TACGATGCAGTT 3---TACGATGCA 3---TACGAT 3---TAC G Tube 3 + N 2 H TACGATGCAGTTGA 3---TACGATGCAGT 3---TACGATGCAG 3---TACGATG 3---TACGA 3---TA 3--- C + T Tube 4+ N 2 H 4 -NaCl 3---TACGATG 3---TA C ATGCTACGTCAACTA-----3

42 La méthode de Maxam and Gilbert CG ATGCTACGTCAACTA ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCA ATGCTACGTC ATGCTACGT ATGCTACG ATGCTAC ATGCTA ATGCT ATGC ATG ATAT A Migration Lecture A+GT+C

43 Séquençage de lADN : la méthode de Sanger

44 Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTGA -----TACCATGCA -----TACCA -----TA Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTGAT -----TACCATGCAGTT -----TACCATGCAGT -----TACCAT -----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGC -----TACC -----TAC Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTG -----TACCATGCAG -----TACCATG ATGCTACGTCAACTA TACGATGCAGTTGAT Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP dATP radioactif P32

45 Autoradiographie du gel de séquence ACGT ATGCTACGTCAACTA ATGCTACGTCAACT ATGCTACGTCAAC ATGCTACGTCAA ATGCTACGTCA ATGCTACGTC ATGCTACGT ATGCTACG ATGCTAC ATGCTA ATGCT ATGC ATG ATAT A Migration Lecture ddATP ddTTPddCTP ddGTP

46 Fluorescence (Diagramme de Jablonski ) S0S0 S 1 S1S1 Energie h h FAM max = nm Em max = nm

47 Pigments

48 Marquage fluorescent 1)Dye-labeled primer sequencing colorant attaché en 5 du primer 2) Internal labeling colorant attaché à un dNTP et incorporé durant la synthèse du nouveau brin dADN 3) dye-labeling terminator sequencing colorants attaché à un ddNTP

49 Point dancrage du pigment

50 Dye-labeled primer sequencing Tube 4+ ddATP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTGA ----TACCATGCA ----TACCA ----TA Tube 1 + ddTTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTGAT ----TACCATGCAGTT ----TACCATGCAGT ----TACCAT ----T Tube 2 + ddCTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGC ----TACC ----TAC Tube 3 + ddGTP -----ATGCTACGTCAACTA TACCATGCAGTTG ----TACCATGCAG ----TACCATG ATGCTACGTCAACTA TACGATGCAGTTGAT Primer ADN polymérase dATP, dTTP, dCTP et dGTP

51 d-Rhodamine dye-labeled terminators ddC-EO-5dTMRddT-EO-6dROX

52 d-Rhodamine dye-labeled terminators ddT-PA-5dR6G ddT-EO-5dR110 PA, propargylamino - EO, propargyl ethoxyamino

53 ddT-BigDye terminator excitation émission Transfert dénergie

54 Gel de séquence


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