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Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile Christophe Léger, Bioénergétique et Ingénierie des Protéines,

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1 Des électrodes pour étudier et utiliser les hydrogénases: du mécanisme catalytique à la biopile Christophe Léger, Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, CNRS Marseille Vincent et al, Chem. Rev. (2007) Vincent et al, Chem. Commun. (2006) Liebgott et al, Nat. Chem. Biol. (2010)

2 Spectro RPE (1980+) Spectro IR (1994+) Cristallo- graphie (1995+) Desulfovibrio gigasXX Allochromatium vinosumXX Desulfobibrio vulgaris MyasakiX Desulfomicrobium baculatum NiFeSe xX Hydrogénases NiFe les plus étudiées par des techniques biophysiques au XX e siècle

3 Spectro RPE (1980+) Spectro IR (1994+) Cristallo- graphie (1995+) Electro- chimie (1999+) Spectro rayons X Mutagé- nèse (1998+) Desulfovibrio gigasXX Allochromatium vinosumXXXX Desulfobibrio vulgaris MyasakixXx Desulfomicrobium baculatum NiFeSe xXx Desulfovibrio vulgaris NiFeSeXX Desulfovibrio fructosovoransXXXXXX Ralstonia eutropha MBH * xXXX Ralstonia eutropha RH * xxx Ralstonia eutropha SHxxxx Ralstonia metallidurans * X Escherichia coli (hyd1 *, hyd2)Xx Acidithiobacillus ferroxidans RHXx Aquifex aeolicus * XXX * Enzyme tolérant le dioxygène Hydrogénases NiFe les plus étudiées par des techniques biophysiques au XX e et XXI e siècles

4 Lenzyme purifiée à lair est un mélange de formes inactives Hatchikian, Cammack et al., FEBS Letts (1982) Formes inactives NiA + NiB + états silencieux Oxydation Réduction Formes actives (dont NiC)

5 Cinétiques complexes dactivation / réactivation Structure des formes inactives encore incertaines NiB (inactif, « ready ») NiA (inactif, « unready ») Oxydation aérobie (par O 2 ) ou anaérobie (DCPIP*) Réduction rapide Réduction lente Hatchikian, Cammack et al., BBA (1986) Volbeda et al., J. Biol. Inorg. Chem (2005) * DCPIP = dichlorophénolindophénol, E 0 =+200mV Formes actives

6 Les applications des hydrogénases requièrent quelles fonctionnent même en présence de dioxygène Vincent et al., Chem. Commun (2006) McKinlay et al., Curr. op. biotech. in press (2010)

7 I. Quelles électrodes pour échanger des électrons avec les hydrogénases?

8 Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode dor + noir de carbone Hydrogénase de Thiocapsa roseopersicina, adsorbée sur or recouvert de noir de carbone INTRODUCTION: « The investigation of enzymes as catalysts for electrochemical processes is a novel area of chemical enzymology. (…) Besides, it is also of interest to study electrochemically the mechanism of the redox enzyme action ».

9 Amstrong et al., Chem. Soc. Rev (1997) Blanford et al., J. Solid. State Electrochem (2006) Image en microscopie électronique après abrasion mécanique Formation dun film protéique Les feuillets « graphènes» Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolitique edge 2H + electrons H2H2 1μm1μm

10 En labsence denzyme Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique edge Potentiel E temps

11 2H + electrons H2H2 H 2 ase de A. vinosum adsorbée sur électrode immobile, 1 atm. Ar Pershad et al, Biochemistry (1999) Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique edge Potentiel E temps

12 1atm H 2, électrode tournante, haute vitesse de balayage: 200mV/s (un cycle en 8s) Léger et al., Biochemistry (2002), J. Phys. Chem. B (2002) Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique edge

13 1atm H 2, électrode tournante, basse vitesse de balayage (0.3mV/s, cette expérience en 1h30) Jones et al., J. Am. Chem. Soc (2003) Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Graphite pyrolytique edge Inactif Oxydation Réduction Actif

14 Acides aminés glutamate près du 4Fe distal Orientation favorable et attachement covalent (couplage carbodiimide) Rudiger et al., J. Am. Chem. Soc (2005) NO 2 Allongue et al., J. Am. Chem. Soc (1997) Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Greffage covalent sur graphite fonctionnalisé ProtéineSurface Carbodiimide Liaison amide

15 Alonso-Lomillo et al., Nano Letters (2007) Adsorption simple Greffage covalent Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Greffage covalent sur nanotubes de carbone fonctionnalisés H 2 ase de D. gigas, pH 7, 1 atm H 2, E=-280mV 50μm 5μm5μm

16 Hoeben et al., Langmuir, (2008) Au + PM + H 2 ase A. vinosum, pH 9, 1mV/s pmol/cm2 (à partir de valeur de kcat en solution) Mica + Au(111) + PM + H 2 ase A. vinosum Image AFM (tapping mode, in air) 0.23 pmol/cm2 Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode dor + polymyxine (PM) PM

17 Hoeben et al, ACS NANO (2008) A vinosum H 2 ase, pH 6, 1.5mV/s Si + 500nm SiO nm Au + 300nm PMMA Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Nanoélectrode dor + polymyxine 100x100 nm 2

18 Des électrodes qui interagissent avec les hydrogénases Electrode dor fonctionnalisée D. vulgaris Miyazaki H 2 ase, pH 5.5, 1mV/s Millo et al, J. Phys. Chem. B (2009) Monocouche auto organisée (SAM) de thiols HS-(CH 2 ) 6 -NH 2 Ar H2H2

19 II. Exemples détudes électrochimiques dhydrogénases: quels déterminants moléculaires de la résistance à loxygène?

20 2H + H2H2 MV réduit (bleu) Méthyl viologène oxydé (incolore) electrons Mesure dactivité classique (spectrophotométrie) activité = vitesse de turnover = nbr moles de H 2 / sec / enzyme (1000 à 10000s -1 ) Facile Laborieux: minutes Contraignant: anaérobicité Pente = vitesse de turnover

21 2H + electrons H2H2 Courant = [enzyme] x turnover Electrode de référence Electrode de travail Contre-electrode H2H2 Electrode tournante, potentiel E La mesure électrochimique dactivité Léger et al., Chem. Rev (2008). Vincent et al., Chem. Rev (2007) Inconvénient: Concentration surfacique le plus souvent inconnue Avantages: Quantités minuscules de matériel biologique Contrôle du potentiel délectrode Présence dO 2 permise (à condition que E élevé) Résolution temporelle

22 Des hydrogénases NiFe très similaires montrent des résistances à lO 2 variées e.g. A. vinosum, versus Ralstonia eutropha MBH Vincent et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA (2005) A.vinosum 1 bar H 2, pH 6, 30oC, E=0.14V R. Eutropha MBH Courant normalisé ( = activité)

23 Site actif Tunnel L122 V74 Ni Fe Le tunnel daccès du substrat détermine-t-il la sensibilité à lO 2 ? 1)Volbeda et al., Int. J. Hydrogen. Energ (2002) 2)Buhrke et al., J. Biol. Chem (2005) 1) Val+Leu gardent lembouchure du tunnel dans lenzyme de D. fructosovorans, standard = sensible à lO 2 Résidus conservés dans la plupart des H 2 ases NiFe Exceptions: Ile+Phe dans enzymes « senseurs » (R. capsulatus, R. eutropha RH) insensibles à lO 2 2) La double mutation IleVal / PheLeu rend lenzyme senseur (RH) de R. eutropha sensible à loxygène

24 Purification de mutants de lhydrogénase de D. fructosovorans (S. Dementin, P. Liebgott, CNRS Marseille) kDa Enzyme pure Mutagenèse dirigée ~10 Transformation de D. fructosovorans ~20 Culture 2727 Purification 290 temps (jours) L122 V74 V74D V74E V74Q V74N V74W V74M V74C V74S V74K V74I V74C V74H V74F L122M L122C L122F L122A L122M-V74M L122A-V74M L122F-V74I L122C-V74C WT

25 pdb 1YQWpdb 3CUS pdb 3CURpdb 3H3X Activité en solution (S. Dementin, P. Liebgott, BIP.) Structures X-ray (A. Volbeda, CEA, Grenoble)

26 La constante de Michaelis K m Henri, C.R. Acad. Sc (1902); Michaelis et al., Biochemisches Zeitschrift (1913)

27 H 2, then Ar La constante de Michaelis K m

28 H 2, then Ar La constante de Michaelis K m

29

30 H2H2 CO La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif)

31 H2H2 CO Inhibition rapide La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif)

32 H2H2 Léger et al., J. Am. Chem. Soc (2004) La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif)

33 CO H2H2 Inhibition lente Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA (2008) La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif)

34 H2H2 Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA (2008) Réactivation lente La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif) Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué

35 Leroux et al., Proc. Natl. Acad. Sc. USA (2008) Modélisation Résultat obtenu avec un mutant dont le canal est partiellement obstrué La vitesse de réaction avec CO (inhibiteur compétitif)

36 Léger et al., J. Am. Chem. Soc (2004) La vitesse de la réaction (irréversible) avec O 2 Modélisation

37 Interprétation: une étape (k 1 /k -1 ) de diffusion dans lun et lautre sens une étape (k 2 /k - 2 ) de fixation/dissociation du site actif G k1k1 k -1 k -2 k2k2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

38 Interprétation: une étape (k 1 /k -1 ) de diffusion dans lun et lautre sens une étape (k 2 /k - 2 ) de fixation/dissociation du site actif G k1k1 k -1 k -2 k2k2 2 observables4 constantes de vitesse Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

39 5 observables10 constantes de vitesse Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

40 La vitesse dinhibition par CO est la vitesse de diffusion de CO vers le site actif Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

41 à fonction constante, chaine latérale augmentée dun CH 2

42 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010) à fonction constante, chaine latérale augmentée dun CH 2 à taille constante, COOH -> CONH 2

43 Les mutations affectent les vitesses dentrée et de sortie de la même façon Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

44 Ralentir la diffusion de O 2 peut augmenter la résistance de lenzyme à O 2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

45 Les mutations affectent la vitesse de diffusion de H 2 Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

46 H 2 diffuse par le même canal mais 30 fois plus vite que O 2 et CO Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010)

47 Cytochrome c oxydase (complexe IV) Acétyl-CoA Synthase / CODH (cf. dernier cours) Photosystème II Lipoxygénase FeFe hydrogénase Nitrogénase Lautier et al., Faraday Discussions 148, in press (2010) Salomonsson et al., Proc. Natl. Acad. Sc USA (2004) Des tunnels conduisent O 2, H 2, CO, N 2 dans de nombreuses autres métalloenzymes

48 Les mutations affectent les vitesses de diffusion in et out Elles font varier les vitesses relatives de diffusion de H 2, CO et O 2 H 2 diffuse plus vite que O 2 et CO Des mutations ponctuelles font varier les vitesses de jusquà 4 ordres de grandeur. Rôle attendu de la taille et surprenant de la polarité Ralentir laccès de O 2 augmente la résistance à loxygène, à condition que la diffusion de O 2 limite la vitesse dinactivation Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010) Diffusion intramoléculaire dans lhydrogénase: principaux acquis de lélectrochimie

49 Ralentir larrivée de O 2 au site actif ne fait que ralentir linhibition Liebgott et al., Nature Chemical Biology 6 63 (2010) Dementin et al., J. Am. Chem. Soc (2009)

50 Inactivation aérobie des H 2 ases: quelle(s) espèce(s) formée(s)? 1) Hydrogénase standard (D. fructosovorans) Lamle et al. J. Am. Chem. Soc (2004) Active forms NiB (inactive, « ready ») NiA (inactive, « unready ») Réactivation rapide Oxydation par O 2 Réactivation lente 1. Enzyme inactivée par O 2 dans conditions oxydantes 2. Réactivées dans conditions moins oxydantes Cinétique de réactivation multiphasique: plusieurs espèces inactives 12

51 Inactivation aérobie des H 2 ases: quelle(s) espèce(s) formée(s)? 2) Hydrogénase « résistante » (A. aeolicus) Pandelia, Fourmond, et al, J. Am. Chem. Soc., sous presse (2010) 1.Inactivation anaérobie dans conditions oxydantes 2.Enzyme inactivée par O 2 3.Se réactive spontanément (réduction inutile) Réactivation complète et monophasique: une seule espèce inactive 123

52 Inactivation aérobie des H 2 ases: quelle espèce formée? 2) Hydrogénases « résistantes » (A. aeolicus) Pandelia, Fourmond, et al., J. Am. Chem. Soc., sous presse (2010) Lenzyme inhibée par O 2 est la même que celle qui se forme par oxydation anaérobie

53 Inactivation aérobie des H 2 ases: quelle espèce formée? 2) Hydrogénase « résistante » (A. aeolicus) La forme produite par réaction avec O 2 est NiB Pandelia, Fourmond, et al., J. Am. Chem. Soc., sous presse (2010) NiB NiR2 NiR2+NiC+NiSia

54 Fourmond, et al, J. Am. Chem. Soc, (2010) Inactivation aérobie des H 2 ases: quel mécanisme? Hydrogénase « résistante » (A. aeolicus)

55 Fourmond, et al., J. Am. Chem. Soc, (2010) Inactivation anaérobie: comparaison dune enzyme sensible à lO 2 (A. vinosum) et dune résistante (A. aeolicus) Mécanisme d(in)activation similaire Vitesse de formation de NiB (k i ) identique Vitesse de réactivation (k a ) beaucoup plus rapide dans le cas de lenzyme « résistante » de A. aeolicus Données A. vinosum: Jones et al., J. Am. Chem. Soc (2003)

56 Acides aminés proches du site actif ? Environnement du site actif NiFe de D. fructosovorans Jaunes: identiques dans la séquence de A. aeolicus Oranges: similaires Rouges: différents Propriétés rédox du site actif ? Chaîne de transfert délectrons ? Les bases moléculaires des propriétés des enzymes résistantes à loxygène toujours inconnues Y77-G V78-C Leroux et al., Int. J. H 2. Energ. online (2010) Ludwig et al., J. Biol. Chem (2009), Saggu et al., ChemPhysChem online (2010) Pandelia, Fourmond, et al., J. Am. Chem. Soc., sous presse (2010)

57 IV. Des électrodes pour utiliser les hydrogénases

58 La pile à combustible Grover, Philosophical Magazine Series 3, (1839) & (1842) Apollo 11, Juillet 1969

59 Catalyseurs à lanode des piles à combustible: Comparaisons entre Pt et hydrogénase adsorbée 1/ ω 1/2 (rpm ½ ) Jones et al. Chem Comm. 866 (2002) H 2 ase NiFe de A. vinosum Oxydation de H 2 (chronoampérométrie) H 2 ase FeFe de C. acetobutylicum Oxydation/production de H 2 (voltammétrie) Hambourger et al. J. Am. Chem. Soc (2008) 1 bar H 2, pH 7, 50mV/s, 3000rpm1 bar H 2, pH 7, 45oC, E=0.24V vs SHE

60 Vincent et al. Proc. Natl. Acad. Sc. USA (2005) Une biopile à combustible sans membrane, utilisant lhydrogénase NiFe de R. eutropha à lanode

61 Faible densité de puissance de la biopile à combustible Bullen et al, Biosensors and bioelectronics, (2006)

62 Vincent et al. Chem. comm (2006), Cracknell et al. J. Am. Chem. Soc (2008) Une biopile qui fonctionne avec une hydrogénase capable doxyder des traces de H 2 dans lair (R. metallidurans)

63 Hambourger et al. J. Am. Chem. Soc (2008) Photoproduction dhydrogène dans une cellule photoélectrochimique Cathode carbone + hydrogénase FeFe de C. acetobutylicum

64 Bio: Sébastien Dementin, Pierre Pol Liebgott, Marc Rousset (D. fructosovorans) Pascale Infossi, M.Thérèse Giudici-Orticoni (A. aeolicus) RPE: Bénédicte Burlat, Emilien Etienne, Bruno Guigliarelli, Electrochimie: Pierre-Pol Liebgott, Fanny Leroux, Vincent Fourmond, Carole Baffert, Pierre Ceccaldi, Patrick Bertrand Bio: Thomas Lautier, Isabelle Meynial, Ph. Soucaille (C. acetobutylicum, INSA Toulouse) Cristallographie: Anne Volbeda, Juan Fontecilla Camps (CEA, Grenoble) Cinétique: Laurent Cournac (CEA, Cadarache) FTIR: Antonio De Lacey (D. fructosovorans, CSIC, Madrid), FTIR, EPR: Maria Pandelia, Wolfgang Lubitz (A. Aeolicus, Max Planck, Mulheim) Collaborations

65 Appel à candidature Thèse à linterface physique/chimie/biologie au laboratoire de Bioénergétique et Ingénierie des Protéines, Marseille Sujet: « Etude pluridisciplinaire dune hydrogénase: mécanisme catalytique et optimisation des propriétés enzymatiques » Profil recherché: chimiste, physicien ou biologiste. Début octobre 2010; les candidats se manifesteront avant le 30 avril. Plus d'informations: Et sur le site du CNRS: https://www2.cnrs.fr/DRH/doctorants-10/


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