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Introduction à la virologie MICROBIOLOGIE DCEM-1 ANNEE UNIVERSITAIRE 2008-2009 Nicolas LEVEQUE CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie Mail :

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1 Introduction à la virologie MICROBIOLOGIE DCEM-1 ANNEE UNIVERSITAIRE Nicolas LEVEQUE CHU Robert Debré-Laboratoire de virologie Mail :

2 Introduction à la virologie Quest-ce quun virus ? La réplication virale Modes de transmission des infections virales

3 Quest-ce quun virus ?

4 « Les virus sont les virus » A. Lwoff 1957

5 20 à 200 nm

6 Les virus Entités nucléo-protéiques (ARN ou ADN) Comprennent toujours au moins deux éléments: le génome et la capside (boite) Lenveloppe dérive de la membrane cellulaire Ne se multiplient pas de manière autonome (réplication) parasites intra-cellulaires obligatoires Absence de croissance

7 Structure Schématique Génome (ADN ou ARN) Capside protéique (capsa) + Nucléocapside (core) = Virus nus Enveloppe (péplos) (bicouche lipidique) + = Virus enveloppés Nucléocapside (core)

8 Le génome viral Un virus = information génétique limitée ARN = fragile doù une taille limitée - 7 kb pour les Picornaviridae et les Astroviridae à 30 kb pour les Coronaviridae - cas du virus de lhépatite delta (1.7 kb) ADN = plus complexes - de 3 à 300 kpb - capacités de codage très différentes: de 4 gènes pour le VHB à plus de 80 pour HSV

9 Structure protéique dorigine virale (une ou plusieurs protéines polymérisées) Protège le génome nucléocapside 3 organisations symétriques –hélicoïdale –cubique ou icosaédrique –complexe La capside

10 De symétrie hélicoïdale Virus de la mosaïque du tabac Paramyxovirus

11 De symétrie cubique

12 De symétries complexes Symétrie cubique Symétrie hélicoïdale Certains bactériophages

13 Lenveloppe virale ou peplos = Bicouche lipidique provenant du système membranaire cellulaire + Protéines /glycoprotéines virales Elément de fragilité (température, dessiccation, sucs digestifs…) Enveloppe cuirasse = tendon dAchille

14 Lenveloppe virale ou peplos Impact sur lépidémiologie Grippe : Transmission directe et rapprochée Favorisée par lair humide et froid hiver Poliovirus : transmission fécale-orale (mains sales, eau ou aliments souillés)

15 Classification des virus Repose sur la structure des virus et non sur le pouvoir pathogène Nature de lacide nucléique (ARN ou ADN) Conformation de la capside (tubulaire ou cubique) Présence ou absence dune enveloppe

16 Rencontre virus/cellule production de nouveaux virus = réplication Phénomène complexe machinerie cellulaire détournée Certaines étapes spécifiques du virus cible pour molécule antivirale Multiplication des virus dans la cellule Virus = parasite intracellulaire obligatoire

17 Information génétique : ARN ou ADN Matière première : Acides aminés, acides gras, sels minéraux Source dénergie : ATP Accélérateurs biologiques = enzymes Multiplication des virus dans la cellule

18 Les différentes étapes du cycle de réplication

19 Multiplication des virus : Ladsorption Contact virus/cellule Protéines de la capside glycoprotéines de lenveloppe Récepteur cellulaire tropisme dhôte (grippe aviaire) tropisme tissulaire (CD4 et VIH)

20 La pénétration : Les barrières cellulaires rencontrées au cours de linfection Cytoplasme Glycocalyx Membrane cellulaireRéseau dactine Milieu extracellulaire

21 Retarder la détection par le système immunitaire Conditions optimales pH, protéases, thioloxydases Adressage cellulaire Préserver lintégrité de la membrane cellulaire

22 Pénétration et décapsidation Fusion Virus enveloppés

23 Lyse/perforation Virus non enveloppés o Pénétration et décapsidation

24 Expression et réplication du génome viral Réplication : duplication du matériel génétique Informations contenues dans génome viral traduites en –protéines non structurales (enzymes, …) –protéines structurales (construction de nouvelles particules virales)

25 Réplication des virus à ADN

26 Réplication des virus à ARN Virus à ARN positif : ARN (+) ARN génomique directement messager synthèse protéique ex : virus de la poliomyélite

27 Virus à ARN négatif : ARN (-) ARN génomique pas directement messager transcription de lARN(-) en ARN (+) nécessaire ARN polymérase ARN dépendante (transcriptase) ARN (+) synthétisé sert dARNm

28 Rétrovirus ARN ADN simple brin ADN double brin ADN proviral intégré RT intégrase

29 ARN HémagglutinineNeuraminidaseAnticorps Acide sialique Glissement antigénique Multiplication des virus La réplication

30 Multiplication des virus Lassemblage Encapsidation du génome viral La libération hors de la cellule èPar éclatement cellulaire pour les virus nus èPar bourgeonnement pour les virus enveloppés

31 Modes de transmission des infections virales

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33

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35 Transmission salivaire Transmission par contact cutané

36 Lutte contre les infections virales Mesures dhygiène : Last but not least

37 Diagnostic des infections virales

38 Pourquoi faire du diagnostic en virologie ?

39 Dons de sang, dorganes et de tissus (dépistage obligatoire) Suivi biologique des infections (VIH, VHB, VHC) Mesures prophylactiques et contrôle des épidémies rota et VRS en pédiatrie - grippe Etudes épidémiologiques (prévalence, réservoir, mode de transmission) Preuve de lorigine virale dune infection +++ chez immunodéprimés Décision thérapeutique développement des antiviraux

40 Recherche des anticorps = Sérologie = Diagnostic indirect Recherche du virus ou de ses constituants = Diagnostic direct = approches complémentaires (fonction du virus recherché et de la clinique) Plusieurs approches Lanalyse comprends plusieurs phases : Prélèvement = phase pré-analytique Choix de techniques et réalisation = phase analytique Validation et interprétation

41 Phase pré-analytique : le prélèvement 1. Choix des prélèvements à effectuer Selon la clinique (toute lésion accessible doit être prélevée) Porte dentrée, sites de multiplication et/ou dexcrétion des virus recherchés 2. Réalisation des prélèvements Importance +++ de la qualité du prélèvement Doit être réalisé le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication +++ pendant phase dincubation) 3. Acheminement des prélèvements au laboratoire Milieux de transport pour virologie (+++ pour culture de virus) Transport rapide Sécurité Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement

42 Diagnostic indirect = sérologie Recherche des anticorps ELISA ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) : substrat développé pour tous types de virus, automatisable, adapté à de grandes séries différencie IgG et IgM

43 Diagnostic virologique La séroneutralisation

44 Sérologie +++ Pour diagnostic des primo-infections = apparition des Ac entre deux sérums dun patient 2 sérums : sérum précoce (neg) – sérum tardif (pos) Pour définir le statut immunitaire vis-à-vis dun virus = savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis (Ac pos) ou non (Ac neg) 1 sérum

45 Diagnostic direct Recherche du virus ou de ses constituants : Détection dantigènes – techniques immunologiques Détection de génome (ADN ou ARN) – biologie moléculaire Détection du virus entier – culture virale Observation des particules virales (microscopie électronique) Si résultat positif avec clinique concordante = preuve de limplication dun virus dans une infection

46 Détection des antigènes du virus : IF, ELISA Techniques simples et rapides à mettre en œuvre mais manque de sensibilité Mise au point des anticorps monoclonaux en Détection : Ag dans des cellules (immunofluorescence) Ag libre ou libéré (ELISA ; agglutination ; immunochromatographie) - contrôle de la spécificité de la réaction +++ selles (rotavirus, adénovirus) pvts respiratoires (VRS, grippe, rougeole) lésions cutanéomuqueuses (HSV, VZV)

47 Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génome DNA polymerase PCR = polymerase chain reaction Très nombreuses copies de lADN … 30 x1989

48 Méthodes actuelles automatisation extraction automatique de lARN (Easymag….) automates de PCR (TaqMan, Light Cycler, Smart Cycler) Diagnostic virologique La RT-PCR entérovirus

49 Sample in, answer out … « La Révolution GeneXpert »… Diagnostic virologique La RT-PCR entérovirus

50 HSV dans LCR pour méningo-encéphalite (urgence) CMV : PCR quantitative (greffés de rein) VIH : PCR qualitative (dépistage chez nouveau-né) et PCR quantitative (charge virale pour suivi thérapeutique) VHC : sérologie + PCR Diagnostic direct : Diagnostic direct : détection du génome Principales applications

51 Equipement +++ hotte à flux laminaire hotte à flux laminaire car manipulations en environnement stérile Microscope Incubateur à CO2 … Incubateur à CO2 … Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

52 Technique de référence Virus = parasites intracellulaires obligatoires Ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes animal (Coxsackievirus A types1 à 6) œuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) cellules en culture in vitro Importance dun transport rapide jusquau laboratoire pour conserver le pouvoir infectieux du virus Dans milieu de transport = MEM + protéines (SVF) + tampon + ATB Diagnostic direct : Diagnostic direct : culture de virus

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54 Microscope électronique

55 Virus du SARS Virus herpes simplex (HSV)

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