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1 1 Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE Projet créatinine Régulation de la fonction rénale.

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1 1 1 Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE Projet créatinine Régulation de la fonction rénale

2 2 2 PLAN I- Le projet II- Démarche expérimentale : les réactions III- Etalonnage électrochimique I- Le projet II- Démarche expérimentale : les réactions III- Etalonnage électrochimique

3 33 I-Le projet

4 44 produit de dégradation du phosphate de créatine dans le muscle. Le sang La sueur La salive Les urines REIN 1) Le projet La créatinine

5 55 Le dosage sanguin Taux normal = 65 – 120 µmol/L ± 20 % (homme) 50 – 100 µmol/L ± 20 % (femme) Insuffisance = 600 – 700 µmol/L ± 20 % Prises de sang régulière A jeun / sans effort physique 1) Le projet Le dosage

6 66 Insuffisance rénale Inconvénient du dosage Sanguin Invasive Source dinfection / douleur 3 millions de personnes 60 % de séniors 25 % de diabétiques Nécessite du personnel médical I- Le projet Actuellement

7 77 I- Le projet Utilisation simple Fiable à ± 10 % Miniaturisation Dosage par Électrochimie Sueur ? Salive ? Dosage par Électrochimie Sueur ? Salive ? Utilisation simple Fiable à ± 10 % Méthode non invasive Miniaturisation Notre but

8 88 Rencontre avec le P. JAOUI Expériences au CIME Achat des réactifs Définir plus précisément les objectifs/ les contraintes du projet Etablir le cahier des charges Se rendre compte de la réalité du projet 1) Le projet Recherches… Recherches préliminaires Rencontre avec le P. ZAOUI Expériences au CIME Salive Déroulement…

9 99 II-LES REACTIONS

10 10 Objectif : savoir si les réactions qui mènent à H fonctionnent ? 3 réactions II- Les réactions Est-ce que ca marche?

11 11 II- Les réactions De la créatinine à H 2 O 2 créatinine + H 2 O créatine (1) créatine + H 2 O créatininase sarcosine (2) sarcosine + H 2 O H 2 O 2 (3) sarcosine oxidase créatinase

12 12 peroxydase H 2 O 2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase H 2 O 2 (en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge) Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H 2 O 2 et donc de la sarcosine => Avoir une quantité raisonable de H 2 O 2 de lordre du µmol La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL peroxydase H 2 O 2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) peroxydase H 2 O 2 (en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge) Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H 2 O 2 et donc de la sarcosine => Avoir une quantité raisonable de H 2 O 2 de lordre du µmol La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL II- Les réactions Détection du H 2 O 2

13 13 La troisième réaction II- Les réactions 7 puits7 puits Différentes quantités de sarcosine oxydaseDifférentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais … A priori tout marche bien, mais … 7 puits7 puits Différentes quantités de sarcosine oxydaseDifférentes quantités de sarcosine oxydase la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … A priori tout marche bien, mais … A priori tout marche bien, mais …

14 14 Mais…Mais… II- Les réactions Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…?? On narrive pas à contrôler la réactionOn narrive pas à contrôler la réaction génant pour la détection génant pour la détection Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…??Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…?? On narrive pas à contrôler la réactionOn narrive pas à contrôler la réaction génant pour la détection génant pour la détection

15 15 créatine + H 2 O créatine-amidinohydrolase sarcosine + urée (créatinase) Solution de créatinase (μL) Solution de sarcosine (μL) Tableau croisé avec concentration=3 U/mol Sarcosine : 50 μL à 1,53 U/mol Créatine : 50 μL à 3 U/mol Solution de sarcosine (μL) Contrôle négatif 20coloration 40optimum 602 nde oxydation Propriétés de lenzyme : - Transforme 1μmol de créatine / minute - Enzyme à diluer à 2,0-3,0 U/mol II- Les réactionsc La deuxième réaction

16 16 La première réaction II- Les réactions On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigoDifférentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mLOn prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigoDifférentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo La réaction ne marche pas La réaction ne marche pas

17 17 ConclusionConclusion II- Les réactions Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°CProblème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsIncompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différents Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresChangement de pH après la 1ère réaction inhibation des autres Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°CProblème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différentsIncompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différents Changement de pH après la 1ère réaction inhibation des autresChangement de pH après la 1ère réaction inhibation des autres

18 18 III- Etalonnage électrochimique

19 Anode H 2 O 2 -> O 2 + 2H + + 2e - Cathode 2H + + 2e - -> H 2 CE I - + WE EDTA/Tris Hcl +H 2 O 2 REF V A Potentiostat Palier de diffusion PrincipePrincipe III- Etalonnage Gamme: 50 -> 300 mM Gamme: 50 -> 300 mM Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H 2 O 2

20 20 Balayage: 20 mV/s 500pts mesure pH=8 WE: Au CE: ITO ER Ag,AgCl 1ère cellule électrochimique Pas doxydation de H 2 O 2 et ITO non inerte III- Etalonnage

21 21 CE: Pt ER Ag,AgCl WE: Pt Balayage: 20mV/s pH=8 V=450 mV FAUX! Courant capacitif ou autre réaction 2ème cellule électrochimique Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel Concentration des ions non constante (tampon dilué!) =>Réfléchir avant dagir!! Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel Concentration des ions non constante (tampon dilué!) =>Réfléchir avant dagir!! III- Etalonnage / Ag,AgCl

22 22 ER Ag,AgCl V=450 mV CE: Pt WE: Au Oxydation de H 2 O / Ag,AgCl Balayage: 20mV/s pH=8 Fuites Mauvaise connection Fuites Mauvaise connection 3ème cellule électrochimique Problèmes possibles: Cinétique H+ Capacité tampon Problèmes possibles: Cinétique H+ Capacité tampon III- Etalonnage

23 23 Conclusion générale Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier Echec courbe étalon: Montage, cinétique H +, capacité tampon Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive Perspectives : Cinétique H + sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon Expérience de la recherche Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier Echec courbe étalon: Montage, cinétique H +, capacité tampon Frustration : pas de dosage de la créatinine dans de la salive Perspectives : Cinétique H + sur Pt (pH=8) => CE plus grande? Vérifier si on dépasse la capacité tampon Expérience de la recherche


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