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DEATH SIGNAL-INDUCED LOCALISATION OF P53 TO MITOCHONDRIA Natalie D. Marchenko, Alexander Zaika, and Ute M. Moll Claire BOUYER, Adrien LEMAIRE MSBi105,

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1 DEATH SIGNAL-INDUCED LOCALISATION OF P53 TO MITOCHONDRIA Natalie D. Marchenko, Alexander Zaika, and Ute M. Moll Claire BOUYER, Adrien LEMAIRE MSBi105, 2009 The Journal of Biological Chemistry, 2000

2 INTRODUCTION Rôle et Régulation de P53 Tiré du cours 2009 de F.RENAUD

3 Structure de P53 Domaine de transactivation Domaine de liaison à lADN Domaine doligomérisation : Homotétramérisation INTRODUCTION

4 Voie de lapoptose indépendante de P53 INTRODUCTION

5 Voie de lapoptose dépendante de P53 INTRODUCTION

6 ETUDE DE LA VOIE NON GENOMIQUE DE P53 INTRODUCTION

7 Expérience 1 : ML-1 : cellule de leucémie myéloide RKO : cellule de cancer du colon La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible entre différents types de lignées cellulaires lors dune apoptose médié par P53 Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie Western-blot dans les cellules RKO Campthothécine : Dommage de lADN RESULTATS Western-blot dans les cellules ML-1

8 La relocalisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène reproductible après induction de différents types de stress cellulaire dans lapoptose médié par P53 Expérience 1 : Campthothécine : Dommage de lADN Desferroxamine (DXE) : stress hypoxique RESULTATS Effet Reproductible de la localisation de P53 à la mitochondrie Western-blot dans les cellules ML-1

9 Expérience 2a : La voie de P53 induite dépend de la drogue utilisée Actinomycine D : arrêt du cycle cellulaire en G1, pas dactivation de lapoptose. Camptothécine et Etoposide : Activation de lapoptose médiée par P53. RESULTATS Choix de la voie induite par P53 après un stress Cytométrie en flux des cellules ML-1

10 Expérience 2b : TNF : Activation de lapoptose indépendante de P53 Actinomycine D : Activation de larrêt du cycle cellulaire par P53 Campthomycine : Activation de lapoptose dépendante de P53 La localisation de P53 à la mitochondrie est un phénomène spécifique de la mort cellulaire par apoptose médiée par P53 RESULTATS P53 se localise à la mitochondrie uniquement lorsquil induit lapoptose WB des cellules ML-1

11 Expérience 2c : Etude de la localisation de P53 après induction de lapoptose médiée par P53 ou de larrêt du cycle cellulaire Actinomycine D : induction de larrêt du cycle cellulaire Camptothécine et Etoposide : Activation de lapoptose médiée par P53 Il ny a pas de P53 qui relocalise à la mitochondrie lors de lactivation de larrêt du cycle cellulaire par P53 RESULTATS Accumulation spécifique de P53 à la mitochondrie lors de lapoptose médiée par P53 Western-blot dans les cellules ML-1

12 Expérience 3a : Etude de la cinétique de localisation de P53 à la mitochondrie et du relargage du cytochrome c Accumulation de P53 à la mitochondrie dès 1h dincubation en présence de Campthomécine Relargage du cytochrome c après 4h Activation des caspases après 4h RESULTATS Cinétique de laccumulation de P53 à la mitochondrie Western-blot dans les cellules ML-1

13 Expérience 3b: La localisation de P53 à la mitochondrie précède lapoptose et nest pas une conséquence de lapoptose Etude de la cinétique de la variation du potentiel de membrane de la mitochondrie Rhodamine 123 : marqueur lipophile sonde du potentiel membranaire Cytométrie en flux Changement de potentiel de membrane après 4h dans les cellules apoptotiques RESULTATS Cinétique de laccumulation de P53 à la mitochondrie

14 Expérience 4a: Cytométrie en flux de mitochondries isolées des cellules ML-1 Cyto ox IV : marqueur protéique de la membrane interne de la mitochondrie Avant apoptose : Cyto ox à lintérieur de la mitochondrie donc non accessible à lAnticorps Après apoptose : degradation de la membrane externe de la mitochondrie, Cyto ox IV dans la membrane interne de la mitochondrie est accessible On observe un profil identique des Anticorps anti-P53 et anti-Cyto ox IV RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie

15 Expérience 4b: Microscopie Electronique des particules dor Anti-P53 Quantification des particules dor Anti-P53 avant ou après traitement à la campthothécine à la mitochondrie RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie P53 à la mitochondrie se situe dans lespace inter membranaire

16 Expérience 4c: Etude de lassociation de P53 à la mitochondrie Mthsp70 (Anticorps monoclonal)=Grp75 (Anticorps polyclonale) : moteur de la transclocation des protéines à lintérieur de la mitochondrie Co-IP de P53 et mthsp70 Immunoprécipitation et WB dans des mitochondries de ML-1 La localisation principale de P53 à la mitochondrie est interne à la mitochondrie après translocation de la membrane par mtHSP70 RESULTATS Localisation de P53 à la mitochondrie

17 Expérience 5b: Système EB1 : une lignée cellulaire du colon humain stable - Expression de P53 sous contrôle de la Métallothionine (ZnCl2) - Homozygotes mutants pour la déletion de P53 pas dapoptose médiée par P53 Avantages : - La réponse apoptotique sera uniquement due à lexpression de P53 et non à linduction dun stress ce qui évite les effets pléiotropes des dommages de lADN - Régulation précise de lexpression de P53 - Les cellules EB1 sont un bon type cellulaire pour létude de lapoptose médiée par P53 RESULTATS Induction de lapoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53

18 Expérience 5b: Pas de P53 si non induction du système Présence de P53 après son induction (8,5h) par ZnCl2 Présence de P53 à la mitochondrie à un niveau similaire au ML-1 caractérise linduction de lapoptose Les cellules déficientes pour P53 pourraeint entrer en apoptose médiée par P53 après induction de lexpression de P53 et accumulation de P53 à la mitochondrie RESULTATS Induction de lapoptose médiée par P53 dans des cellules déficientes pour P53

19 Expérience 5c : Surexpression de Bcl-xL et Bcl-2 anti apoptotique dans les cellules 32D de souris Diminution de la mort cellulaire après surexpression de Bcl-xL La famille Bcl-2 annule leffet apoptotique de P53 à la mitochondrie Pas de P53 si surexpression de Bcl-2 ou Bcl-xL contrairement au contrôle Il y a un lien direct ou indirect entre P53 et les protéines de la famille de Bcl-2 au niveau de la mitochondrie RESULTATS Etude du rôle des régulateurs mitochondriaux de lapoptose sur la localisation de P53 à la mitochondrie

20 Expérience 6 : RESULTATS Induction de lapoptose lors dun dun adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient

21 Expérience 6 : suite RESULTATS Induction de lapoptose lors dun dun adressage direct de p53 à la mitochondrie en contexte p53 déficient

22 CONCLUSIONS Une fraction de p53 se localise à la mitochondrie en cas dapoptose médiée par p53. Phénomène reproductible dans un large spectre de cellules et de stress. Absence de cet évènement en cas dapoptose p53-indépendante. De même lors dun arrêt du cycle en G1 médié par p53. Phénomène rapide (environ 1h) précédant les évènement mitochondriaux. Bcl-2 et Bcl-xL capables de bloquer localisation mitochondriale de p53 lors dun stress induit et apoptose dépendante de p53. p53 capable dinduire lapoptose en labsence daction transcriptionnelle (attention au contexte de surexpression) Ce serait un enhancer de la voie principale qui repose sur les activités de facteur de transcription de P53.

23 PERSPECTIVES Ils posent en perspective quelles sont les protéines susceptibles dinteragir avec p53 et quels sont les régulateurs de lapoptose qui sont activés en réponse. p53 agirait en monomère pour son action non-transcriptionnelle. Des études récentes ont montré que p53 peut directement induire la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe et permettre ainsi le relargage du cytochrome c et lapoptose.


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