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Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in Drosophila B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology KOPLIKU Lela EL.

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1 Modulation of ionising radiation-induced apoptosis by bantam microRNA in Drosophila B.Jaklevic et al.[April 2008] Developmental biology KOPLIKU Lela EL ASRI Hanane

2 I-Introduction Développement de la drosophile

3 I-Introduction MV Iorio and CM Croce (2009) J Clin Oncol 27 Biogenèse et maturation des microRNA (miRs)

4 I-Introduction Bantam microRNA (21nt) inhibe lexpression de Hid Code une protéine de 410 aa Partie N-ter de 14 aa commune = domaine RHG Profil dexpression constitutif Surexpression induit la mort( rôle pro-apoptotique) bantam a un effet anti-apototique 3UTR 5 ARNm hid 35 5 séquences cibles de bantam HID (head involution defective) miRNA bantam

5 I-Introduction Induction de cassures double brins de lADN Activation de p53 Activation de lapoptose Apoptose : réponse clé des radiations ionisantes

6 Quel est le rôle de bantam en réponse aux radiations ionisantes?

7 II-Résultats Fig. 1. Les disques imaginaux dailes ont été disséqués à partir des larves 3.5-4h après irradiation aux rayons-X avec 0R (-IR) ou 4000R (+IR), et colorées avec lAcridine Orange. La perte de fonction de ban induit laugmentation de lapoptose spontanée (-IR) et induite (+IR) EP:allèle hypomorphe :Délétion du locus ban a- Effets des rayons-X sur les mutants ban Rayon X

8 II-Résultats EGFP bantam sensor transgène constitué du promoteur de tubuline, de la séquence codante de lEGFP fusionnée à deux copies de la séquence cible de ban en 3UTR (appelé bantam sensor) bantam sensor(3UTR) Une diminution du signal EGFP reflète une augmentation de lactivité du répresseur ban. Promoteur tubuline EGFP b- Effets des rayons-X sur lactivation de ban

9 II-Résultats Fig. 2 3 ème stade larvaire La fluorescence de lEGFP a été analysés dans les disques imaginaux dailes après 5,18 ou 24 h dirradiation avec 0 ou 4000 R Les radiations ionisantes induisent lactivation de ban EGFP ban sensor diminue au cours du temps Rayon X Augmentation de lactivité de ban au cours du temps => b- Effets des rayons-X sur lactivation de ban

10 II-Résultats Fig. 3 Irradiation des larves après 96h+/-4h du dépot des œufs. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. % éclosion= pourcentage de pupes qui éclosent donnant des adultes viables. ban est requis pour assurer la survie de lorganisme après irradiation c- Importance de ban au niveau de lorganisme

11 II-Résultats Fig. 4. Les larves sont homozygotes pour p53 5A-1-4 et pour linsertion 20.X duban sensor. (A, B) La fluorescence dEGF a été analysée 24 h après irradiation dans les disques imaginaux dailes. (D) Le niveau dEGFP a été analysé par Western blot à partir des extraits larvaires. p53 est requis pour lactivation de ban En contexte mutant p53 la quantité dexpression de « ban sensor » ne diminue pas sous leffet des rayons X EGFP ban sensor ban nest pas activé chez les mutants p53 => d- Effets de p53 sur lactivation de ban

12 Hypothèse 1 : Après irradiation,p53 induirait lactivation de ban via laugmentation de son niveau dexpression Rayon X p53 miRNA bantam Cassure double brins ? + + EGFP -ban sensor Récapitulatif 1 Effet des rayons X dans les disques imaginaux dailes de larves

13 II-Résultats pas de changement significatif du niveau dexpression de ban après irradiation. Fig. 5 Extraction de lARN total de larves WT (A) et homozygotes mutantes p53 (B) Analyse du niveau dexpression du miRNA ban mature. exposition des larves aux Rayons X 0(-) ou 4000 R(+) Northern blot Quantification Northern blot => P53 active ban sans augmenter son niveau dexpression d- Effets de p53 sur lactivation de ban

14 Hypothèse 2: Lapoptose serait nécessaire à lactivation de bantam après irradiation p53 miRNA bantam Rayon X apoptose Lactivation de p53 est nécessaire à lactivation de ban p53 active lapoptose Récapitulatif 2 Cassure double brins Effet des rayons X dans les disques imaginaux dailes de larves

15 II-Résultats Fig. 6. Les disques imaginaux dailes des larves controles (A, B) et irradiés (C, D) ont été analysés pour la fluorescence dEGFP (A, B) ou pour la coloration en Acridine Orange (B, D) 24h après irradiation aux rayons-X à 0 ou 4000 R. Hh-GAL4>UAS-p35: expression de p35 dans la partie postérieur du disque imaginal daile La mort cellulaire est requise pour une activation optimale de ban après irradiation. Contrôle: Partie antérieur de laile corrélation entre labsence dapoptose et l inactivation de bantam p35 e- Effets de linhibition de lapoptose sur lactivation de ban

16 Récapitulatif 3 Effet des rayons X dans les disques imaginaux dailes de larves p53 apoptose + + miRNA bantam

17 II-Résultats Fig. 7. Les disques imaginaux dailes contrôle (A, C) et irradiés (B, D) ont été analysés par la fluorescence EGFP 24 h après irradiation aux rayons-X avec 4000R. Les larves sont homozygotes pour le hid- 3UTR sensor (A, B; hid) ou le hid 3UTR sensor delété pour les deux sites cibles de ban (C, D; hid Δ 1,4). Lexpression de hid-3UTR sensor est réduit au niveau des disques imaginaux irradiés. 53 hid Δ 1,4 EGFP ARNm hid 3UTR sensor Lexpression de hid Δ 1,4 n est pas réduit au niveau des disques imaginaux irradiés. hid est une cible importante de ban en réponse aux irradiations f- Effet de lirradiation sur la régulation de lexpression de hid par ban

18 II-Résultats Fig. 8. Les larves ont été irradiés à 96+/- 4 h après dépôt des œufs aux rayons-X. Toutes les larves irradiés ont formés des pupes. Le pourcentage des pupes qui éclosent et donnent des adultes,a été quantifié 10 jours après irradiation. La suppression de hid sauve les mutants ban de la sensibilité aux irradiations g- Effet de la suppression de hid dans les mutants ban

19 Récapitulatif 4 Effet des rayons X dans les disques imaginaux dailes de larves p53 apoptose + + miRNA bantam 3UTR ARNm hid 5 Survie des larves 3 Inhibition de lexpression de hid miRNA bantam

20 III-Conclusion Les rayons X induisent une augmentation de lactivité de ban dans les disques imaginaux et permettent la survie des cellules et des larves irradiées via linhibition de hid imliqué dans la voie apoptotique.

21 IV-Discussion Comment ban est activé dans les cellules? Hypothèse : les cellules apoptotiques activeraient ban de manière non-autonome cellulaire! Par quel mécanisme moléculaire est régulé lactivation de ban? Lactivité de ban augmente après irradiation, alors que son niveau reste inchangé! Voie Hippo: voie suppresseur de tumeur conditions normales : ---| ban Après irradiations Modèle hypothétique Est-ce quil y a dautres cibles de ban? Comment la cellule choisi entre apoptose et survie cellulaire. Hpo Yorkie p53 Hpo

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