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1 Critères bactériologiques daction des antibiotiques : les concentrations critiques P.L. TOUTAIN ECOLE NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Update mars.

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1 1 Critères bactériologiques daction des antibiotiques : les concentrations critiques P.L. TOUTAIN ECOLE NATIONALE VETERINAIRE T O U L O U S E Update mars 2012 Pour aller sur notre site si vous avez récupéré nos dia ailleurs

2 2 Pharmacodynamie des antibiotiques 1.Paramètres in vitro defficacité 2.Paramètres in vivo defficacité

3 3 Indicateurs daction & deffet des antibiotiques 1.In vitro: critères bactériologiques –Statiques CMI, CPM,.... –Prise en compte du temps EPA –Dynamiques vitesse bactéricide 2.in vitro & in vivo : indices mixtes PK/PD –AUC/MIC, Cmax/MIC, Temps au dessus de la CMI 3.In vivo –bactériémie, hyperthermie, leucocytose, GMQ, survivants/décès, évolution des flores...

4 4

5 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Critères bactériologiques 1-In vitro & statique Buts 1.Établir le niveau de sensibilité des pathogènes à lantibiotique (mesure de puissance de lantibiotique) Concentration minimale antibactérienne (CMA) Concentration minimale inhibitrice (CMI) Concentration minimale bactéricide (MBC) 2.Prévenir le développement dune population de mutants résistants Concentration préventive de mutants (CPM)

6 6 CMA : Concentration Minimale Antibactérienne Concentration inférieure à la CMI entraînant les premières modifications morphologiques ou physiologiques de la bactérie ex. : production d'enzymes autolytiques / attachement in vivo/ accélération de la phagocytose

7 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa La CMI

8 CMI ( Concentration Minimale Inhibitrice): définition Plus petite concentration (mg/L) capable, in vitro, d'interdire une croissance bactérienne pendant 24h – mesure effectuée avec un inoculum de départ de 10 5 / ml Concentration bactériostatique Evalué indirectement en utilisant les antibiogrammes 8

9 9 Détermination de la CMI Méthode de dilution en milieu liquide (macrométhode avec des tubes ou microméthode avec des cupules) Méthode de dilution en milieu solide E-test (diffusion sur disque) Détermination avec des automates

10 10 Détermination de la CMI par une méthode de dilution en milieu liquide 1. préparation dune série de tubes à hémolyse avec le milieu de culture liquide (2 mL) pour constituer une gamme de concentrations de l'antibiotique à tester (ex: 0.5 1, 2, 4, 8, 16 µg/mL c.a.d selon une progression géométrique de base 2. Un tube (contrôle) servira de témoin de croissance de la souche à tester. 2. On ajoute la même quantité de germes dans chacun tube (inoculum: 5 x 106 / ml). 3.La galerie préparée sera incubée à 37°C pendant 18 heures. 4. lecture à l'oeil nu

11 CMI : Concentration dans le premier tube pour lequel il n'y a pas de croissance visible après 24h à 37°C CMI Détermination de la CMI

12 12 Détermination de la CMI Broth dilution

13 13 E-test

14 14 E-test : principe 1.Un gradient de concentrations d'antibiotique est obtenu sur une bandelette plastifiée. 2.La bandelette (une bandelette par antibiotique) est déposée à la surface d'une boite de Pétri ensemencée avec la suspension de la bactérie à tester

15 15 E-test :lecture 3.Après un nuit d'incubation à 37°C dans une étuve, on peut lire directement la valeur de la CMI au niveau de la zone à lire.

16 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse E-test Avantages –mesure plus précise de la CMI qu'avec un disque –Utilisé en MH pour des infections sévères ou pour certains germes –En MV, devrait permettre de saffranchir de la principale limite de lantibiogramme qui est la valeur des breakpoints retenus qui sont ceux de la MH Limites –Cher et long à réaliser et non validé en MV par les organismes normatifs

17 17 Difficultés dans la détermination de la CMI P.Lees

18 18 Difficulté dans lévaluation dune CMI liée à lhétérogénéité du prélèvement qui peut être constitué dun mélange de germes ayant des CMI différentes

19 19 Sensibilité in vitro à lamoxicilline et la gentamicine de 20 isolats différents de E Coli provenant du même prélèvement On notera lhétérogénéité des résultats suggérant que la population responsable de linfection nest pas homogène mais se présente plutôt comme un « essaim » avec des germes ayant des CMI individuelles allant de 1 à 10

20 20 Difficultés dans lévaluation dune CMI liées aux aspects techniques de la mesure de la CMI

21 21 Le pas de dilution (1, 2, 4, 8…) donne une progression géométrique La vraie CMI est inférieure à celle qui est annoncée; elle est située entre le premier tube ayant une absence totale de croissance et le précédent Biais potentiel de 100%

22 22 Effet inoculum (faible) pH CO 2, O 2 Amino-acides Nécessité d'une standardisation des essais pour garantir leur reproductibilité (CLSI) Influence des conditions in vitro d'évaluation sur les résultats

23 23 Lorian, p35 influence du pH sur laction des antibiotiques x x x x x pH Zone diameters (mm) Chlortétracycline Streptomycine

24 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Limite de la CMI : sa valeur dépend de la taille de linoculum

25 25 - Certains AB (Bêtalactamines, Quinolones ) ont leur activité réduite en présence d'une population bactérienne importante (ce qui est le cas lors dinfection) - in vivo, on peut atteindre des densités de UFC alors que les CMI sont mesurés à 10 5 UFC - Importance de commencer rapidement une antibiothérapie (métaphylaxie) L'effet inoculum sur la détermination de la CMI

26 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Objectives: To determine the relationship between the density of bacteria (St Aureus) and the PD of 6 antibiotics (ciprofloxacin, gentamicin, vancomycin, linezolide..). Methods: In vitro time–kill, MIC estimation & PK/PD simulations Results: Inoculum effects on efcacy for all 6 antibiotics (density-dependent declines in the rate and extent of antibiotic-mediated killing and increases in MIC).

27 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa MICs estimated with different inoculmum densities, relative to that MIC at 2x10 5 Ciprofloxacin Gentamicin Linezolid Daptomycin Oxacillin Vancomycin

28 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Conclusions: PK/PD indices would be more predictive of the efficacy of antibiotics if, instead of using conventional estimates of the MIC, density dependent functions of MICs were employed as the denominators of these

29 29 Effet matrice sur la détermination de la CMI sérum Lait Exsudat Urine Bile LCR

30 30 MIC: serum vs. lait Staphylococcus aureus –Nécessite 4 fois plus dantibiotique pour être inhibé dans le lait que dans le plasma

31 31 CMI: Action des antibiotique in vivo vs in vitro

32 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Différences entre les conditions in vitro et in vivo pour déterminer une CMI In vitro 1.Concentrations statiques 2.pH physiologique, conditions optimales pour la croissance 3.Milieu sans protéine, tout lantibiotique étant libre 4.Évaluation arbitraire à 24 h 5.Pas de système immunitaire 6.Inoculum de faible taille et constant In vivo 1.Concentrations variables 2.Conditions de croissance variables et limitation possible à la croissance 3.Présence de protéines réduisant la fraction libre 4.Évaluation possible in vivo mais pas à un temps prédéterminé 5.Système immunitaire coopératif 6.Inoculum de taille variable

33 33 Acidité de l'abcès Anaérobie Conditions différentes de la périphérie au centre Populations bactériennes variables en taille et en vitesse de croissance Peut contenir une population mixte Inactivation possible des aminoglycosides et des sulfamides Action des antibiotiques in vivo vs in vitro (ex : un abcès)

34 34 Utilité et usage des CMI 1. Thérapeutiques sélection rationnelle d'un antibiotique 2. Epidémiologiques surveillance des résistances

35 35 1.La CMI est considérée comme une bonne approximation de la concentration libre dantibiotique quil est nécessaire dobtenir au site dinfection pour éradiquer un pathogène 2.Cest la raison pour laquelle les concentrations plasmatiques des antibiotiques sont « comparées » aux CMI des pathogènes extracellulaires (pour les intracellulaires, cela est différent)

36 36 La CMI est le critère PD retenu dans la construction des indices PK/PD defficacité –T>MIC –AUC/MIC –Cmax/MIC

37 37 Utilisation des CMI à des fins épidémiologiques Pour avoir accès a la base européenne des CMI des différents pathogènes et pour les différents antibiotiques ( y compris certains antibiotiques dusage strictement vétérinaire), pour connaître les valeurs critiques des antibiogrammes (S/I/R), etc. aller sur le site Eucast2 Eucast2

38 38 Distribution des CMI de la gentamicine pour E Coli (population sauvage)

39 39 La CMB

40 40 CMB : Concentration minimale bactéricide Plus petite concentration (mg/L) capable, in vitro, d'entraîner une inhibition irréversible de la croissance bactérienne (mort bactérienne) En pratique, éradication de 99.9% (3 log) d'un inoculum bactérien (10 6 ) en h

41 CMB : Concentration dans le premier tube repiqué avec la culture du tube de la CMI pour lequel il n'y a pas de recroissance visible (correspond au premier tube stérilisé) CMB Détermination de la CMB CMI Tous les tubes sont ensemencés avec la culture du tube ayant donné la CMI (tube non stérile) Recroissance Pas de recroissance

42 42 La bactéricidie s'effectue selon des dynamiques temporelles variables et pertinentes à connaître On préfère évaluer la vitesse de bactéricidie à la CMB CMB : Concentration minimale bactéricide

43 43 Rapport CMB / CMI Phénomène de tolérance : si R > 32 Antibiotiques bactériostatiques vs bactéricidies (bactéricides si CMB = CMI)

44 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa La CPM

45 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Concentration préventive de mutants (CPM) & notion de fenêtre de sélection : la concentration à prendre en compte pour prévenir lémergence de résistance (surtout pour des quinolones)

46 46 Pression de sélection pour les concentrations inférieures à la CMI; CMI temps Concentration Hypothèses traditionnelles lémergence de résistance

47 47 CMP: le problème Dans un large inoculum, il est probable davoir une ou plusieurs sous-population à CMI plus élevée que la majorité du reste de la population à cause du taux spontané des mutations (ex: ) La sous population à CMI élevée sera sélectionnée lorsque que la population mixte est exposée à des concentrations en antibiotique supérieures à la CMI de la population sauvage (qui sera alors éradiquée) mais inférieures à la CMI de la sous-population ayant mis en place un mécanisme de résistance (qui sera la seule à pouvoir se développer) et qui sous la pression de sélection de lantibiotique finira par devenir la population dominante

48 48 Hypothèses actuelles sur lémergence de résistance: dynamique des populations bactériennes

49 49 CPM (Concentration Préventive de Mutants) La CMP est la CMI de sous population(s), qui dans un large inoculum, a mis en place les premiers mécanismes de résistance En pratique, cest la concentration prévenant le développement dun inoculum de taille 10 9_ La méthode de détermination est la même que la CMI mais linoculum passe de 10 5 à 10 9 _ 10 10

50 50 Notion de fenêtre de sélection CPM (Concentration préventive de mutants) (pour inhiber la croissance de la sous population ayant faut un premier saut mutationnel CMI (pour bloquer la population sauvage) Plasma concentrations Inhibition de toutes les Bie Croissance de la seule sous population mutante Croissance de toutes les Bie Fenêtre de sélection des mutants

51 51 La fenêtre de sélection La CMI et la CMP définissent une gamme de concentrations nommées fenêtre de sélection Cest la différence entre la CPM et la CMI

52 52 Notion de fenêtre de sélection

53 53 La fenêtre de sélection La fenêtre de sélection est la gamme des concentrations en antibiotique située entre la CMI et la CMP In vivo, la taille des inoculums étant élevées, on suspecte la présence de sous-populations à CMI plus élevées et qui seront sélectionnée si lexposition à lantibiotique est suffisante pour éradiquer la population sauvage mais insuffisante pour éradiquer la sous population résistante (mécanisme de sélection de résistance pour les quinolones) On doit fermer la fenêtre de sélection en choisissant des schémas posologiques garantissant des concentrations supérieures aux CMP (souvent 5 fois la CMI)

54 54 Les mutants ne sont pas sélectionnés en dessous de la CMI et au dessus de la CPM

55 55 Les indices de prévention des mutants Rapport MPC/CMI (définit la largeur de la fenêtre de sélection) –De 4 à 8 pour les quinolones et pour le triméthoprime; 16 pour la doxycycline (MRSA); Temps passé dans la fenêtre de sélection –(voir le chapitre consacré à ce sujet)

56 56 Stratégies pour limiter le développement de résistance 1.Rester au dessus des CPM –Posologies adéquates (one shoot; AUC/MIC=250h) 2. réduire létendue de la fenêtre de sélection –Objectif de développement pour lindustrie. 3.Traiter les animaux en métaphylaxie –Faible inoculum 4. avoir recours à des associations intelligentes dantibiotiques (tuberculose chez lhomme).

57 57 Temps post-administration Concentration plasmatique 1.Posologie pour que les concentrations plasmatiques libres passent au dessus de la CPM (toutes les bactéries seront éradicables) Stratégies pour limiter le développement de résistance: posologie adéquate CPM CMI

58 58 AUC/MIC > 125 h Garantir une AUC/MIC>125h veut dire que lon garantit que la concentration plasmatique moyenne sur lintervalle de dosage est 5 fois la CMI (voir la présentation des indices PKPD) Avec une AUIC/MIC de 250h (10 fois la CMI) on observe une éradication bactérienne très rapide (environ 2 jours) Application vétérinaire: « one shoot » Nécessité de réviser les schémas posologiques

59 59 Temps post-administration Concentration plasmatique 1.Dose au dessus de la CPM Stratégies pour limiter le développement de résistance: fermer la fenêtre de sélection CPM CMI 2.Fermer la fenêtre de sélection CPM~CMI Innovations pharmaceutiques pour avoir le plus petit rapport entre la CPM et la CMI; cela permet davoir des posologies plus faibles pour éradiquer les mutants

60 60 Valeurs des CMI & CPM pour les quinolones vétérinaires sur E coli et Staph aureus

61 61 Emergence vs. sélection de mutants résistants par les quinlones Les quinolones peuvent favoriser lémergence ou la sélection de mutants résistants –Pour de faibles concentrations (inférieures aux CMI), ils augmentent le taux de mutations et partant lapparition de mutants. Stimulation du système SOS génère des hypermutateurs –Pour les concentrations situées dans la fenêtre de sélection, ils sélectionnent les mutants dejà présents

62 62 Objectifs thérapeutiques liés à la fenêtre de sélection

63 63 Antibiotiques pour lesquels le concept de fenêtre de sélection sapplique Quinolones Bêta-lactams Macrolides Tétracyclines

64 64 Days Log CFU/g of feces Ampicilline dans leau de boisson Inoculation de S liquefaciens From Duval-Yflah Y. et al. IAI 1980; 28 :981 Résistance à la colonisation par Serratia liquefaciens ( ) multirésistante in vivo dans le tube digestif de souris à flore humaine [E. coli ( )]. Évènement sans sélection Sélection Amplification

65 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa Diseasehealth Therapy Metaphylaxis (Control) Prophylaxis (prévention) Growth promotion Stratégies pour limiter le développement de résistance: la métaphylaxie High Pathogen load Small No NA Antibiotic consumption

66 PL Toutain Ecole Vétérinaire Toulouse Ispaïa

67 67 curatif Stratégies pour limiter le développement de résistance: la métaphylaxie qui doit être vue comme un traitement très précoce métaphylaxie pop sauvage sensible Pop sauvage Population de simple mutants présente au début du traitement donc mutants sélectionnables Pas de mutants car linoculum initial au moment du traitement est trop faible pour avoir généré des mutants et donc pas de risque de sélection

68 68 Quelles sont les concentrations pour prévenir la sélection de bactéries à sensibilité réduite? Beta-lactamines: –Toujours rester au dessus de 4xMIC –(mais 40-60% du temps >CMI pour efficacité) Aminoglycosides: –Avoir au moins un pic de 8x MIC Fluoroquinolones: – AUC/CMI > 200 et pic /CMI > 8


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