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CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre.

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1 CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre

2 plan Généralités (définition, classification, DJA, LMR, expositions)Généralités (définition, classification, DJA, LMR, expositions) Des facteurs de risque pour la santé chez lhommeDes facteurs de risque pour la santé chez lhomme Les cibles cellulairesLes cibles cellulaires Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

3 Les pesticides : généralités Définition toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de sopposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole Classification selon leur activité biologique - les insecticides - les fongicides -les herbicides - les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…) Classification par famille chimique: - Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.) - Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion) - Composés organométalliques (Dérivés de lurée, carbamates, etc.) - pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

4 - Tous les produits phytosanitaires sont soumis à une Autorisation de Mise sur le Marché - Les études toxicologiques et écotoxicologiques sont réalisées par lindustriel - Lanalyse du dossier toxicologique est assurée par des experts indépendants, nommés dans différentes commissions Les procédures d'évaluation du risque Evaluation du risque Dose journalière admissible DJA Limite maximale de résidus LMR Persistance Les pesticides : généralités

5 Les limites maximales de résidus (LMRs en mg/kg) dans les denrées sont établies par couple "matière active-denrée" à partir des données toxicologiques et agronomiques. Elles reflètent les bonnes pratiques agricoles (utilisation des quantités minimales nécessaires pour protéger efficacement les cultures), qui aboutissent à des niveaux de résidus acceptables, c'est-à-dire sans effet sur la santé. La dose journalière admissible (DJA en mg/kg/j) pour lhomme est déterminée pour chaque substance active retenue, : la quantité maximale de produit pouvant être absorbée quotidiennement par lhomme au cours de toute sa vie, sans apparition deffet quelconque. Pour cela, on se base sur une dose sans effet (DSE) tirée détudes toxicologiques menées sur des animaux (dans le cadre du dossier dhomologation). Les pesticides : généralités

6 dose Pas deffet toxiqueZone de toxicité Dose sans effet : DSE Effet toxique Dose toxique DSE (pour lanimal) DJA ( mg/kg/jour chez lhomme) LMR (aliment, mg/kg) dose journalière acceptable (DJA) limite maximale de résidu (LMR) Les pesticides : généralités

7 Persistance Généralement appréciée en calculant la demi-vie du composé, c'est-à- dire le temps nécessaire pour que disparaisse la moitié de la quantité (ou de la concentration) de résidus présents dans le milieu (ou l'organisme) 2 jours Glyphosate 130 joursParathion 2 ansLindane 15 ansDDT Demi-vie Polluant La persistence dun composé dépend aussi du type de sol Les pesticides : généralités

8 - - Les plans de contrôle sont plus nombreux et mieux organisés - - Les agriculteurs sont mieux informés et formés - - Interdiction des substances les plus dangereuses - - Les tonnages utilisés tendent à diminuer - Réduction de moitié du nombre de substances homologuées (800 en 1990; 489 en 2005) 2600 préparations commerciales règlementations sévères Les pesticides : généralités

9 Usage agricole (90%) - 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) Usage non agricole (10%) - traitement des parasites dans la maison - traitement des bois et textiles - soins des animaux - traitement des plantes dintérieurs, jardins, espaces verts Les pesticides : généralités

10 Exposition professionnelle 1.3 millions de personnes professionnellement exposées en France X2 avec les retraités Exposition non professionnelle Exposition non professionnelle : La population en générale Les pesticides : généralités

11 Exposition via lenvironnement et lalimentation Transfert (absorption, volatilisation) vers eau de surface, air, sols (eaux profondes) Rétention Dégradation EAUX pesticides détectés entre 2001 et 2003 dans les eaux de distribution, de surface et souterraines sauf les eaux montagneuses - 9 familles chimiques différentes mais surtout les triazines (herbicide) - - recherche limitée par les seuils de détection - - quelques dépassement ponctuel de la LMR (triazine, urée substituée (diuron) et organochlorés) - - augmentation de la présence de métabolites de pesticides (DEA/atrazine) AIR - Aucune norme pour réglementer les teneurs en pesticides dans lair ambiant - - Associations agrées de la qualité de lair (AASQA) - - présence de pesticides à la fois dans lair urbain ou rural (Folpel (fongicide vigne) SOLS - Pas de dispositif de surveillance pour caractériser la contamination diffuse des sols par les pesticides Pesticides : généralités

12 les aliments Commission des Communautés Européennes Recherche de 500 substances actives dans échantillons Direction Générale Concurrence Consommation et Répression des Fraudes (DGCCRFF 2003) Très peu de non- conformité pour les denrées animales Parmi les fruits et légumes étudiés (3000 échantillons, 236 pesticides) - 50% ne porte pas de résidus des pesticides recherchés % contiennent des résidus avec une valeur LMR % contiennent plusieurs résidus Selon lOMS, pour les non professionnels la principale source dexposition - alimentation 80% - eau 10% Les pesticides : généralités

13 salade= 6 pesticides différents poisson = 3 tomates= 5 blé = 5 Vin = 5 Produits laitiers = 3 Fraises = 4 pommes= 3 Poivrons = 8 Etc.. Pour le consommateur Exposition chronique à de faibles doses de pesticides en mélange Les pesticides : généralités

14 Lexposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de pathologies graves comme : - certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson - -certaines déficiences au niveau du développement cérébral - - Des troubles de limmunité - -Des troubles de la reproduction - -Des perturbations endocriniennes Études épidémiologiques dans les populations exposées Les pesticides : des facteurs de risques

15 Les cancers hématopoïétiques sont avec les tumeurs du cerveau, les cancers les plus fréquemment retrouvés chez les enfants dans les populations exposées. La survenue dautres types de cancers (tumeurs cérébrales, tumeurs germinales) ou des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de limmunité ont été rapportés. Exposition professionnelle des parents seraient associées à diverses pathologies chez les enfants Effet de l exposition professionnelle des parents sur la santé des enfants Les pesticides : des facteurs de risques

16 Certains pesticides, sont capables dinduire in vitro dans des cellules humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire Les pesticides : des facteurs de risques

17 Cibles cellulaires des pesticides Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la prolifération de la survie

18 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification pesticides Dommages à lADN la génotoxicité REPARATION ADN Ralentissement du cycle cellulaire Système dexcision et réparation des dommages Système enzymatique de réparations des cassures Les différents dommages à lADN sont: les bases oxydées (8oxodG), les coupures simples et doubles brins, les adduits à lADN Dans les lymphocytes dagriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de lADN (MN) (Tope A. et al, 2006) Augmentation des adduits à lADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff,,2005) Dans les cellules fibroblastiques de rat le mancozeb (fongicide, dithiocarbamate) induit des cassures simples brins après une heure dexposition à de faibles doses (Calviello G., et al, 2005). Oxydation de la lADN dans le foie de rat (8 oxoDg) après traitement des animaux avec un mélange de 15 pesticides (0.75 à 10 mg/kg) (M. Lodovici et al, 1994) lésions spontanées / jour/ cellule Cibles cellulaires des pesticides

19 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques mutation RNA, Protéines Cellule transformée Stimulation de la prolifération de la cellule transformée Promotion tumeur Accumulation danomalies génétiques définitives dans des gènes contrôlant la survie et la prolifération Initiation Conséquence de la génotoxicité des pesticides ? Réparation de l ADN Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules. Cibles cellulaires des pesticides

20 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques mutation Réparation de l ADN Cellules transformées initiation promotion tumeur ARN Protéines Mort cellulaire programmée Ex Mancozeb induit une génotoxicité dans les cellules fibroblastiques de rat en culture qui conduit à linduction de la mort cellulaire programmée (Calviello et al, 2005) Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

21 mort cellulaire programmée apoptose Processus physiologique de régulation du nombre de cellules Au cours du développement embryonnaire, Dans la défense immunitaire Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

22 Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée » modifications structurales Plusieurs étapes en cascade, dont les effets sont visualisables dans les cellules : –flip-flop de la phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique –Boursouflure membranaire –fragmentation de l'ADN nucléaire –fragmentation du cytoplasme, formation des corps apoptotiques

23 Apoptose Modifications biochimiques P53 Independent pathways Ca++ Modification de la répartition des phospholipides membranaires Hydrolase Cytosolique inactives Hydrolase Cytosolique actives P53 Dependent pathways Lésions irréversibles des protéines cytosoliques Ex le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et lactivation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003) Ex le paraquat dichloride, un herbicide, induit lapoptose via linduction de P53 (Takeyama N, et al, 2004) Hydrolyze des enzymes de réparation de l'ADN (PARP) Et des enzymes de structure : gelsoline lamine Fragmentation de l'ADN Cascade d'activation d'enzymes APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP- ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9. Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose

24 la génotoxicité dun xénobiotique peut être due à son pouvoir pro- oxydant qui conduit à une variation du statut oxydo-réducteur de la cellule Cibles cellulaires des pesticides

25 Statut oxydo-réducteur : définition ROS espèces oxygénées réactives Echec régulation statut redox Stress oxydant Attaque lipide, DNA, protéines O2 Chaine mitochondriale Inflammation Défenses cellulaires PROTECTION Initiation Promotion: expansion clonale Croissance et Instabilité génétique tumeur Dégâts cellulaires Mutation DNA apoptose Réparation DNA Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase) glutathion Anti-oxydants vit E, C cytoP450 Facteurs environnementaux Radiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques Radicaux primaires dérivent de loxygène (OH., O2., NO.) jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux Cibles cellulaires des pesticides

26 Exemple deffet pro-oxydant des pesticides La vinclozoline ou liprodione (fongicide) diminue le taux de glutathion intracellulaire, et augmente le taux de radicaux libres dans les cellules HepG2 après une heure de traitement à 25 ou 100µg/ml. Radice S et al, Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo- réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie lactivité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006 Le malathion (OP) inhibe lactivité des enzymes de régulation du stress oxydant, diminue la production dATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie, le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, Lalachlore et le chlorpyrifos (insecticides), induisent in vitro (cellules PC12 neuronales) un stress oxydant conduisant à une peroxydation lipidique, des cassures simples et double brins de lADN, ainsi quà une induction de protéine heat shock. Bagchi D., et al, 1996 Cibles cellulaires des pesticides

27 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la survie de la prolifération Cibles cellulaires des pesticides La transduction du signal

28 Tout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire via une succession dévènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) Cascade de phosphorylation déphosphorylation La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT) La transduction du signal peut se faire soit via - - La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires - -Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine) - - L interaction directe dune molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation Cibles cellulaires des pesticides

29 Les intermédiaires Ex : Le glyphosate, un herbicide, retarde lactivation du complexe CDK1/cycline B (Marc J, et val, 2001) Ex : Lendosulfan, la dieldrine active la voie des MAP kinases (ERK1 et 2). Bulayeva NN et al, 2004 EX les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, Cibles cellulaires des pesticides

30 Elimination du conjugué les systèmes de détoxification xénobiotiques Mort cellulaire programmée Transduction du signal Statut oxydo-réducteur la génotoxicité La régulation de la prolifération de la survie Toxicologie cellulaire et moléculaire Les approches Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

31 Estimation de la viabilité MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm) Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

32 Génotoxicité I Comet assay mesure des cassures induites - -directement par un agent génotoxique, - - indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - - lors de processus secondaires de fragmentation de lADN tel que lapoptose. - Principe : électrophorèse en gel dagarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent. Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

33 Génotoxicité les noyaux dont lADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont lADN nest pas endommagé restent ronds

34 Génotoxicité Taux de mutation du gène HPRT (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) Voie de recyclage des nucléotides puriques à partir dhypoxanthine et guanine (ou de ses analogues) La perte de ces fonctions (mutation inactivante du gène) permet aux cellules de proliférer en présence de 6-Thioguanine HPRT normal + 6-thioguanine cytotoxicité HPRT muté + 6-thioguanine croissance normale

35 Stress oxydant Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les radicaux libres Mesure de lactivité des enzymes régulant le stress oxydant - SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H2 H2O2 + O2 - Catalase: 2H2O2 2 H2O + O2 - Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH 2 H2O + GS-SG Dosage des taux de glutathion Dosage des marqueurs périphérique doxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS) marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4- hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation danticorps Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

36 Signalisation cellulaire Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

37 Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier lexpression de plusieurs protéines dun même extrait cellulaire Plateforme Biopuces Génopôle Toulouse Midi Pyrénées Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulaire

38 Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité de fluorescence qui est le reflet de la quantité dADN Sub G0/G1Cellules apoptotiques G1 G2/M Cytométrie en flux Double marquage iodure de propidium/ lanexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à lextérieur et peuvent fixer lanexine. Les membranes ne sont pas perforées et liodure de propidium ne pénètre pas. Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

39 TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling Détection des fragments dADN en marquant lextrémité terminal des acides nucléiques avec un dUTP qui sera ensuite identifié par un marquage fluorescent DNA Ladder migration de lADN sur gel dagarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit quune seule bande. Cells containing DNA strand nicks characteristic of apoptosis are detected by TUNEL and fluoresce green, while necrotic cells are stained with red-fluorescent propidium iodide Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

40 Mesure de lactivité des caspases effectrices (3) Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose

41 conclusion Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules. Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement Quen est-il de leffet des mélanges et des faibles doses

42 Laurence Gamet-Payrastre

43 les homologues Bcl-2 influencent notamment lintégrité des mitochondries et régissent ainsi la formation de lapoptosome. Les homologues suppresseurs (anti-apoptotiques) dapoptose peuvent lier et séquestrer APAF-1, et inhiber les homologues activateurs (pro-apoptotiques)susceptibles de provoquer louverture de pores dans la membrane mitochondriale : cette ouverture, quand elle intervient, entraîne la libération du cytochrome c et des inhibiteurs dIAP dans le cytosol. Dautres homologues pro-apoptotiques, dits sensibilisateurs, ont pour fonction dinhiber les homologues anti-apoptotiques ; certains dentre eux interagissent également avec des activateurs pour potentialiser les fonctions de ces derniers. Le facteur APAF-1 et le cytochromec peuvent alors coopérer pour dimériser la pro-CASP-9, formant ainsi lapoptosome et la mettant aussitôt en activation. Il sensuivra une cascade amplificatrice dactivation de caspases effectrices.

44 Génotoxicité Test des micronoyaux cytokinesis-block micronucleus(CBMN ) dans les lymphocytes humains Examens les noyaux interphasiques de lymphocytes exposés à des substances génotoxiques, après une culture cellulaire et l'obtention de lymphocytes binucléés - estimation des cassures - perte de chromosomes FISH : fluorescent in situ hybridization: réarrangements chromosomiques


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