CONTAMINANTS ALIMENTAIRES Exemple des pesticides

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1 CONTAMINANTS ALIMENTAIRES Exemple des pesticides
ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre

2 plan Généralités (définition, classification, DJA, LMR, expositions)
Des facteurs de risque pour la santé chez l’homme Les cibles cellulaires Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaire

3 Les pesticides : généralités
● Définition toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole ● Classification selon leur activité biologique - les insecticides - les fongicides -les herbicides - les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…) ● Classification par famille chimique: - Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.) - Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion) - Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)  - pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "

4 Les pesticides : généralités
Les procédures d'évaluation du risque - Tous les produits phytosanitaires sont soumis à une Autorisation de Mise sur le Marché - Les études toxicologiques et écotoxicologiques sont réalisées par l’industriel - L’analyse du dossier toxicologique est assurée par des experts indépendants, nommés dans différentes commissions Evaluation du risque Dose journalière admissible DJA Limite maximale de résidus LMR Persistance

5 Les pesticides : généralités
● Les limites maximales de résidus (LMRs en mg/kg) dans les denrées sont établies par couple "matière active-denrée" à partir des données toxicologiques et agronomiques. Elles reflètent les bonnes pratiques agricoles (utilisation des quantités minimales nécessaires pour protéger efficacement les cultures), qui aboutissent à des niveaux de résidus acceptables, c'est-à-dire sans effet sur la santé. ● La dose journalière admissible (DJA en mg/kg/j) pour l’homme est déterminée pour chaque substance active retenue, : la quantité maximale de produit pouvant être absorbée quotidiennement par l’homme au cours de toute sa vie, sans apparition d’effet quelconque. Pour cela, on se base sur une dose sans effet (DSE) tirée d’études toxicologiques menées sur des animaux (dans le cadre du dossier d’homologation).

6 Les pesticides : généralités
dose journalière acceptable (DJA) limite maximale de résidu (LMR) Effet toxique dose Pas d’effet toxique Zone de toxicité Dose sans effet : DSE Dose toxique DSE (pour l’animal) DJA (mg/kg/jour chez l’homme) LMR (aliment, mg/kg)

7 Les pesticides : généralités
Persistance Généralement appréciée en calculant la demi-vie du composé, c'est-à-dire le temps nécessaire pour que disparaisse la moitié de la quantité (ou de la concentration) de résidus présents dans le milieu (ou l'organisme) 2 jours Glyphosate 130 jours Parathion 2 ans Lindane 15 ans DDT Demi-vie Polluant La persistence d’un composé dépend aussi du type de sol

8 Les pesticides : généralités
règlementations sévères Les plans de contrôle sont plus nombreux et mieux organisés Les agriculteurs sont mieux informés et formés Interdiction des substances les plus dangereuses Les tonnages utilisés tendent à diminuer - Réduction de moitié du nombre de substances homologuées (800 en 1990; 489 en 2005) 2600 préparations commerciales

9 Les pesticides : généralités
Usage agricole (90%) - 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) Usage non agricole (10%) - traitement des parasites dans la maison - traitement des bois et textiles - soins des animaux - traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts

10 Les pesticides : généralités
Exposition professionnelle 1.3 millions de personnes professionnellement exposées en France X2 avec les retraités Exposition non professionnelle : La population en générale

11 Exposition via l’environnement et l’alimentation
Pesticides : généralités Exposition via l’environnement et l’alimentation Transfert (absorption, volatilisation) vers eau de surface, air, sols (eaux profondes) Rétention Dégradation EAUX 332 pesticides détectés entre 2001 et 2003 dans les eaux de distribution, de surface et souterraines sauf les eaux montagneuses - 9 familles chimiques différentes mais surtout les triazines (herbicide) recherche limitée par les seuils de détection quelques dépassement ponctuel de la LMR (triazine, urée substituée (diuron) et organochlorés) augmentation de la présence de métabolites de pesticides (DEA/atrazine) AIR - Aucune norme pour réglementer les teneurs en pesticides dans l’air ambiant Associations agrées de la qualité de l’air (AASQA) présence de pesticides à la fois dans l’air urbain ou rural (Folpel (fongicide vigne) SOLS - Pas de dispositif de surveillance pour caractériser la contamination diffuse des sols par les pesticides

12 Les pesticides : généralités
les aliments Selon l’OMS, pour les non professionnels la principale source d’exposition - alimentation 80% - eau 10% Commission des Communautés Européennes Recherche de 500 substances actives dans échantillons Direction Générale Concurrence Consommation et Répression des Fraudes (DGCCRFF 2003) ►Très peu de non- conformité pour les denrées animales ► Parmi les fruits et légumes étudiés (3000 échantillons, 236 pesticides) - 50% ne porte pas de résidus des pesticides recherchés. - 44 % contiennent des résidus avec une valeur <LMR 6.6% contiennent des résidus avec une valeur >LMR 23.7% contiennent plusieurs résidus

13 Les pesticides : généralités
Pour le consommateur Exposition chronique à de faibles doses de pesticides en mélange 6 3 5 4 1 8 salade= 6 pesticides différents poisson = 3 tomates= 5 blé = 5 Vin = 5 Produits laitiers = 3 Fraises = 4 pommes= 3 Poivrons = 8 Etc..

14 Études épidémiologiques dans les populations exposées
Les pesticides : des facteurs de risques Études épidémiologiques dans les populations exposées L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de pathologies graves comme : - certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson certaines déficiences au niveau du développement cérébral Des troubles de l’immunité Des troubles de la reproduction Des perturbations endocriniennes

15 Les pesticides : des facteurs de risques
Effet de l’ exposition professionnelle des parents sur la santé des enfants Exposition professionnelle des parents seraient associées à diverses pathologies chez les enfants Les cancers hématopoïétiques sont avec les tumeurs du cerveau, les cancers les plus fréquemment retrouvés chez les enfants dans les populations exposées . La survenue d’autres types de cancers (tumeurs cérébrales, tumeurs germinales) ou des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité ont été rapportés.

16 Les pesticides : des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire

17 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la prolifération de la survie xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée

18 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué la génotoxicité Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006) Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005) Dans les cellules fibroblastiques de rat le mancozeb (fongicide, dithiocarbamate) induit des cassures simples brins après une heure d’exposition à de faibles doses (Calviello G., et al, 2005). Oxydation de la l’ADN dans le foie de rat (8 oxoDg) après traitement des animaux avec un mélange de 15 pesticides (0.75 à 10 mg/kg) (M. Lodovici et al, 1994) pesticides les systèmes de détoxification Dommages à l’ADN Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG), les coupures simples et doubles brins, les adduits à l’ADN REPARATION ADN Ralentissement du cycle cellulaire Système d’excision et réparation des dommages Système enzymatique de réparations des cassures lésions spontanées / jour/ cellule

19 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules. Réparation de l ’ADN RNA, Protéines xénobiotiques les systèmes de détoxification mutation Accumulation d’anomalies génétiques définitives dans des gènes contrôlant la survie et la prolifération Initiation Conséquence de la génotoxicité des pesticides ? Cellule transformée Stimulation de la prolifération de la cellule transformée Promotion tumeur

20 Mort cellulaire programmée
Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose Elimination du conjugué Réparation de l ’ADN Protéines ARN xénobiotiques mutation les systèmes de détoxification Cellules transformées initiation Mort cellulaire programmée Ex Mancozeb induit une génotoxicité dans les cellules fibroblastiques de rat en culture qui conduit à l’induction de la mort cellulaire programmée (Calviello et al, 2005) promotion tumeur

21 mort cellulaire programmée apoptose
Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose mort cellulaire programmée apoptose Processus physiologique de régulation du nombre de cellules ■ Au cours du développement embryonnaire, ■ Dans la défense immunitaire ■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif

22 Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »  modifications structurales
Plusieurs étapes en cascade, dont les effets sont visualisables dans les cellules : flip-flop de la phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique Boursouflure membranaire fragmentation de l'ADN nucléaire fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques

23 Cibles cellulaires des pesticides conséquence de la génotoxicité : apoptose
Apoptose Modifications biochimiques Ex le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003) Ex le paraquat dichloride, un herbicide, induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004) P53 Independent pathways P53 Dependent pathways Modification de la répartition des phospholipides membranaires Ca++ Hydrolase Cytosolique inactives actives Hydrolyze des enzymes de réparation de l'ADN (PARP) Et des enzymes de structure : gelsoline lamine Fragmentation de l'ADN Cascade d'activation d'enzymes Lésions irréversibles des protéines cytosoliques APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.

24 Cibles cellulaires des pesticides
la génotoxicité d’un xénobiotique peut être due à son pouvoir pro-oxydant qui conduit à une variation du statut oxydo-réducteur de la cellule

25 Cibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur : définition Stress oxydant Attaque lipide, DNA, protéines Dégâts cellulaires Mutation DNA apoptose Facteurs environnementaux Radiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques O2 mitochondriale Chaine Echec régulation statut redox Réparation DNA Initiation Promotion: expansion clonale Croissance et Instabilité génétique tumeur Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.) jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux ROS espèces oxygénées réactives cytoP450 Inflammation Défenses cellulaires PROTECTION Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase) glutathion Anti-oxydants vit E, C

26 Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides
Cibles cellulaires des pesticides Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides La vinclozoline ou l’iprodione (fongicide) diminue le taux de glutathion intracellulaire, et augmente le taux de radicaux libres dans les cellules HepG2 après une heure de traitement à 25 ou 100µg/ml. Radice S et al, 1998. Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta RK et al, 2006 Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006. Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007. L’alachlore et le chlorpyrifos (insecticides), induisent in vitro (cellules PC12 neuronales) un stress oxydant conduisant à une peroxydation lipidique, des cassures simples et double brins de l’ADN, ainsi qu’à une induction de protéine heat shock. Bagchi D., et al, 1996

27 Cibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la survie de la prolifération xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée La transduction du signal

28 Cibles cellulaires des pesticides La transduction du signal
Tout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire via une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) La transduction du signal peut se faire soit via La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine) L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation Cascade de phosphorylation déphosphorylation La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :en les activant directement (exemple : facteur AP-1) en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT) Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation

29 Cibles cellulaires des pesticides
Ex : Le glyphosate, un herbicide, retarde l’activation du complexe CDK1/cycline B (Marc J, et val, 2001) Ex : L’endosulfan, la dieldrine active la voie des MAP kinases (ERK1 et 2). Bulayeva NN et al, 2004 EX les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005. Les intermédiaires

30 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Elimination du conjugué Statut oxydo-réducteur Transduction du signal La régulation de la prolifération de la survie xénobiotiques la génotoxicité les systèmes de détoxification Mort cellulaire programmée Toxicologie cellulaire et moléculaire Les approches

31 Estimation de la viabilité
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire Estimation de la viabilité MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm) Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes

32 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Génotoxicité I Comet assay mesure des cassures induites directement par un agent génotoxique, indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose. - Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent.

33 Génotoxicité les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds

34 Génotoxicité Taux de mutation du gène HPRT (hypoxanthine phosphoribosyltransferase) Voie de recyclage des nucléotides puriques à partir d’hypoxanthine et guanine (ou de ses analogues) La perte de ces fonctions (mutation inactivante du gène) permet aux cellules de proliférer en présence de 6-Thioguanine HPRT normal + 6-thioguanine → cytotoxicité HPRT muté + 6-thioguanine → croissance normale

35 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire
Stress oxydant Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les radicaux libres Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant - SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2 - Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2 - Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG Dosage des taux de glutathion Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS) marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps

36 Signalisation cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire Signalisation cellulaire Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire

37 Génopôle Toulouse Midi Pyrénées
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulaire Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire Plateforme Biopuces Génopôle Toulouse Midi Pyrénées

38 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose
Sub G0/G1Cellules apoptotiques G1 G2/M Cytométrie en flux Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité de fluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .

39 Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose
TUNEL Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling Détection des fragments d’ADN en marquant l’extrémité terminal des acides nucléiques avec un dUTP qui sera ensuite identifié par un marquage fluorescent DNA Ladder migration de l’ADN sur gel d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du gel dans le cas de cellules apoptotiques sinon on ne voit qu’une seule bande. Cells containing DNA strand nicks characteristic of apoptosis are detected by TUNEL and fluoresce green, while necrotic cells are stained with red-fluorescent propidium iodide

40 Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)
Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptose Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)

41 conclusion Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules. Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses

42 Laurence Gamet-Payrastre

43 les homologues Bcl-2 influencent notamment l’intégrité des mitochondries et régissent ainsi la formation de l’apoptosome. Les homologues suppresseurs (anti-apoptotiques) d’apoptose peuvent lier et séquestrer APAF-1, et inhiber les homologues activateurs (pro-apoptotiques)susceptibles de provoquer l’ouverture de pores dans la membrane mitochondriale : cette ouverture, quand elle intervient, entraîne la libération du cytochrome c et des inhibiteurs d’IAP dans le cytosol. D’autres homologues pro-apoptotiques, dits sensibilisateurs, ont pour fonction d’inhiber les homologues anti-apoptotiques ; certains d’entre eux interagissent également avec des activateurs pour potentialiser les fonctions de ces derniers. Le facteur APAF-1 et le cytochromec peuvent alors coopérer pour dimériser la pro-CASP-9, formant ainsi l’apoptosome et la mettant aussitôt en activation. Il s’ensuivra une cascade amplificatrice d’activation de caspases effectrices.

44 Génotoxicité Test des micronoyaux
cytokinesis-block micronucleus(CBMN ) dans les lymphocytes humains Examens les noyaux interphasiques de lymphocytes exposés à des substances génotoxiques, après une culture cellulaire et l'obtention de lymphocytes binucléés - estimation des cassures - perte de chromosomes FISH : fluorescent in situ hybridization: réarrangements chromosomiques