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M ÉTHODES A NALYTIQUES POUR ÉTUDES TOXICOLOGIQUES Marlène Lacroix 26/01/2012.

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1 M ÉTHODES A NALYTIQUES POUR ÉTUDES TOXICOLOGIQUES Marlène Lacroix 26/01/2012

2 Source dexposition A NALYTIQUE DANS LES E TUDES TOXICOLOGIQUES 2 Absorption Distribution Métabolisme Elimination Effets biologiques Evaluation de la contamination : Matrices environnementales (sols, air, eaux, aliments…) Etude du contaminant et des ses métabolites dans lorganisme : Matrices biologiques (sang, tissus, urines, fèces…) Etude de biomarqueurs : Endogènes (Hormones, Acides aminés, Lipides…) ou exogènes dans matrices biologiques

3 3 L ES TECHNIQUES ANALYTIQUES PRINCIPALES Immunochimique (Elisa, RIA, Chemiluminescence) Chromatographique (HPLC, GC, CE)

4 4 D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE : P RINCIPE Principe basé sur la reconnaissance spécifique antigène – anticorps Traceur Dosage avec compétition Dosage sans compétition Radiomarqué Radioimmunoassay (RIA) Immunoradiometric assay (IRMA) Enzyme Enzymoimmunoassay (EIA) Enzyme-labeled immunosorbent assay (ELISA) Fluorescent Fluoroimmunoassay (FIA) Immunofluorometric assay (IFMA) Luminescent Luminoimmunoassay (LIA) Immunoluminometric assay (ILMA) 2 méthodes de dosage : Réactifs en excès (dosage sans compétition) Réactifs limitant (dosage avec compétition) Classification des méthodes de dosage :

5 5 Reconnaissance spécifique antigène – anticorps Plaque 96 Puits 1.Introduction des anticorps 2.Introduction de léchantillon 3.Liaison de la molécule dintérêt avec lanticorps Anticorps Molécules à doser Autres Molécules D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION

6 6 Reconnaissance spécifique antigène – anticorps Plaque 96 Puits Anticorps Molécules à doser Autres Molécules 1.Introduction des anticorps 2.Introduction de léchantillon 3.Liaison de la molécule dintérêt avec lanticorps 4.Lavage, retrait des molécules non liées D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION

7 7 Plaque 96 Puits 1.Introduction des anticorps 2.Introduction de léchantillon 3.Liaison de la molécule dintérêt avec lanticorps 4.Lavage, retrait des molécules non liées 5.Ajout dun 2 ème anticorps Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION

8 8 Plaque 96 Puits 1.Introduction des anticorps 2.Introduction de léchantillon 3.Liaison de la molécule dintérêt avec lanticorps 4.Lavage, retrait des molécules non liées Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection 5.Ajout dun 2 ème anticorps 6.Lavage et retrait des anticorps en excès Lanticorps de détection peut être radiomarqué ou fluorescent

9 9 1.Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à lanticorps de détection Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION Cas des dosages ELISA : Enzyme-Labeled ImmunoSorbent Assay

10 10 1.Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à lanticorps de détection P RINCIPE ELISA 2.Un substrat de lenzyme est ajouté et lenzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente) Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme Substrat

11 11 1.Un anticorps secondaire lié à une enzyme, se lie à lanticorps de détection P RINCIPE ELISA 2.Un substrat de lenzyme est ajouté et lenzyme le converti en une forme détectable (colorée ou fluorescente) Anticorps Molécules à doser Anticorps de détection Anticorps secondaire lié à une enzyme Substrat Substrat converti

12 12 Réponse du signal Concentration D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE SANS COMPÉTITION Interprétation des résultats : Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H 3 …), compteur γ ( I 125 …) Domaine quantifiable Dosage sans compétition : Intensité du signal proportionnelle à la concentration de la substance à doser

13 13 D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION Anticorps (limitant) Antigènes à doser Antigènes marqués (en excès)

14 14 D OSAGE IMMUNOCHIMIQUE AVEC COMPÉTITION Anticorps (limitant) Antigènes à doser Antigènes marqués (en excès) 14 Réponse du signal Concentration Réponse du signal quantifiée par spectrométrie (UV, Fluorescence…) ou par compteur de radioactivité : compteur β (H 3 …), compteur γ ( I 125 …) Domaine quantifiable Dosage avec compétition : Intensité du signal inversement proportionnelle à la concentration de la substance à doser

15 M ÉTHODES CHROMATOGRAPHIQUES :P RINCIPE 15 Pompes AB Colonne Détecteur Injecteur Bille de silice greffée High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

16 U NE HISTOIRE D AFFINITÉ … Phase stationnaire Analytes Phase mobile Détecteur Chromatogramme temps Intensité 16 PolairesPolaireApolaire Phase directe

17 U NE HISTOIRE D AFFINITÉ … Phase stationnaire Analytes Phase mobile Détecteur Chromatogramme temps Intensité 17 PolairesPolaireApolaire Phase directe

18 U NE HISTOIRE D AFFINITÉ … Phase stationnaire Analytes Phase mobile Détecteur Chromatogramme temps Intensité 18 ApolairesApolairePolaire Phase inverse

19 D ÉTECTEURS Caractérisés selon leur sélectivité et leur sensibilité Les plus répandus pour analyse de biomolécules: UV et Fluo Faisceau lumineux à λ dans ultraviolets Excitation de la molécule Détection UV Limite de quantification de lordre µg/mL Émission de la lumière Détection Fluorescence Limite de quantification de lordre ng/mL Sensibilité x

20 Spectromètre de masse Ionisation des molécules Formation des charges Séparation des ions m/z produits Ex: Electrospray Comptage des ions Amplification du signal Traitement informatique Ex: Trappe dion Ex : Quadripôle SourceAnalyseurDétecteur 20

21 Source electrospray (ESI) Sonde electrospray Cône Sortie de colonne Ionisation des molécules en sortie de colonne 21

22 V ERS L ANALYSEUR … + H + Mesure le rapport m/z dune molécule m = masse monoisotopique z = charge Exemple 1 : Aspirine (acide acétylsalicylique) 9 atomes de Carbone (m C = 12) 8 atomes dHydrogène (m H = 1) 4 atomes dOxygène (m O = 16) m aspirine = 9 x12 +8 x1 + 4x16 = 180 Milieu basique chargée <0 Rapport m/z = 179/1 = 179 m/z Abondance relative % 179 massif isotopique z = 1 22

23 R H+H+ Exemple 2 : Mesure le rapport m/z dune molécule Dérivé de vancomycine Formule : C 80 H 87 Cl 3 F 3 N 11 O 24 Masse monoisotopique = 1750 Plusieurs sites basiques Spectre de masse : Chargé 1x m/z = =1751 Chargé 2x m/z = (1750+2)/2 = 876 Chargé 3x m/z = (1750+3)/3 = 584 H+H+ 23

24 Exemple : Analyseur quadripolaire quadripôle 24

25 Avec un triple quadripôle Cellule de collision « MS » simple « SIM » sélection dion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Mode danalyse Q1Q2Q3 SourceDétecteur 25 Appareil de référence pour études quantitatives

26 Mode danalyse ס « MS » simple « SIM » sélection dion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Q1Q2Q3 ions + Spécifique - Spécifique Les quadripôles laissent passer tous les ions Applications en bioanalyse : Études de pureté Quantification (concentration de lordre du µg/mL) 26

27 Mode danalyse « MS » simple « SIM » sélection dion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Q1Q2Q3 ions + Spécifique - Spécifique Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini Applications en bioanalyse : Quantification Screening de molécules Concentrations µg/mL 27

28 Mode danalyse « MS » simple « SIM » sélection dion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Q1Q2Q3 Ions + Spécifique - Spécifique Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini Énergie de collision : gaz inerte (argon) Fragmentation dans le deuxième quadripôle Passage des ions fils dans le troisième quadripôle Ion « père » Ions « fils » Applications en bioanalyse : Études structurales(métabolomique, protéomique…) Quantification (+ sensible que MS ou SIM) « MS/MS » fragmentation 28

29 Mode danalyse « MS » simple « SIM » sélection dion « MS/MS » fragmentation « MRM » mode pour la quantification Q1Q2Q3 Ions + Spécifique - Spécifique Le premier quadripôle sélectionne un ion à un m/z défini Énergie de collision : gaz inerte (argon) Fragmentation dans le deuxième quadripôle Sélection dun ion fils dans le troisième quadripôle Ion « père » Ions « fils » Applications en bioanalyse : Quantification Screening de molécules Concentrations ng/mL 29

30 Couplage LC/MS Spectromètre de masse utilisé comme détecteur Chromatogramme Temps Intensité Σ Spectres de masse Abondance relative % Rapport m/z 30

31 31 A VANTAGES – I NCONVÉNIENTS ImmunochimieChromatographie Méthodes rapides Méthodes sensibles Forte capacité déchantillon Utilisation facile Méthodes sensibles LC/MS spécifique Dosages de plusieurs molécules en une analyse Pas toujours sélectives Dosage 1 molécule à la fois Elaboration difficile Purification échantillon nécessaire Durée analyse Coût appareillage élevé

32 32 A PPLICATION : ÉTUDES TOXICOCINÉTIQUE /T OXICODYNAMIE Administrati on Réponse biologique Profils de concentration Toxicodynamie Dose Toxicocinétique Quantification du contaminant (et métabolites) Etudes de biomarqueur Collecte Analyse Toxicocinétique Toxicodynamie

33 33 A DMINISTRATION Produit chimique, produit naturel isolé, etc. Choix dun solvant daministration Documenter la stabilité du produit Attention aux substances peu solubles Verifier les doses administrées (analytique) Produit de formulation Essai pilote Doses commerciales (produits pharmaceutiques) Peu être inexacte Impuretés (± 5%) Se référer à la directive pour les produits pharmaceutiques Good Manufacturing Practice (GMP) Vérifier les doses administrées (analytique) Mode dadministration Perfusion, Bolus…. Doses simples, multiples Voie dadministion (IV reference, orale….) A définir dans le protocole expérimental

34 34 S TRATÉGIE DE PRÉLÈVEMENT Un bon prélèvement Ponction ou cathéter (prélèvement sanguin) Site de prélèvement (veine, artère…) Temps de prélèvement (durée, cycle circadien, …) Un bon traitement ou préparation des spécimens Sang total, plasma, serum… Tubes de collecte (anticoagulant, type de tube…) Conditions de centrifugation Filtration (urines) Une bonne conservation pour sassurer de la stabilité des substances et de leurs métabolites Température de conservation (-20°C, -80°C…) Durée de conservation avant analyse Pour chaque spécimen collecté il faut garantir : A définir dans le protocole expérimental

35 A NALYSE ET VALIDATION DE MÉTHODES 35 Valeurs des concentrations les plus fiables possibles Sélectivité/spécificité Linéarité Exactitude Précision (répétabilité/reproductibilité) Sensibilité Stabilité PARAMÈTRES FONDAMENTAUX Certifie que la méthode est appropriée pour une utilisation routinière Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM), May Texte de Référence :

36 S ÉLECTIVITÉ /S PÉCIFICITÉ T (min) Réponse Aire interférence < 5% LOQ Aire à LOQ Définitions : Sélectivité : Capacité à différencier et quantifier un analyte en présence dautres substances dans la matrice Spécificité : Propriété de la méthode analytique de convenir exclusivement à lanalyte avec la garantie que le résultat ne provient que de lanalyte. (absence interférence) Exemple : 36

37 Linéarité : courbe de calibration Définition : Rapport entre les concentrations connues et les réponses analytiques expérimentales (observées). Objectif : Déterminer les concentrations des échantillons SI Analyte Chromatogramme : Utiliser un standard interne et utiliser le ratio : 37

38 Origine de lerreur : Précision et exactitude o Erreur systématique (non aléatoire) Biais Impossible de le corriger Cest lexactitude (accuracy) o Erreur aléatoire On peut lévaluer avec des statistiques Cest la précision Illustration avec des cibles Méthode précise et exacte Méthode peu précise et exacte Méthode précise et biaisée Méthode peu précise et biaisée 38

39 Mesure de lexactitude o Comparaison entre moyenne des concentrations calculées et valeur théorique Exactitude (%) = 100 x Moy Cpréd - Cnom Cnom +100 Critères dacceptabilité : 85 % < Exactitude <115 % X Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de concentrations: (Bas (3*LOQ), Milieux, Haut) o Lexactitude dune méthode analytique est létroitesse de laccord entre la moyenne dune série de concentration obtenue par le modèle et la concentration réelle de lanalyte. 39

40 Mesure de la précision o Pour une précision intra-jour et/ou inter-jour sur plusieurs concentrations : Analyse de variance (ANOVA) Critères dacceptabilité : CV < 15 % Points QC « Quality Controle » 5 QC à 3 niveaux de concentrations Précision intra-jour (répétabilité) Précision inter-jour (reproductibilité) Evaluation sur 3 jours Calculée avec le coefficient de variation (CV%) o La précision dune méthode analytique mesure lécart de chaque mesure individuelle par rapport à la moyenne des mesures dun volume déchantillon unique et homogène X1X1 X2X2 CV % = Écart type Moyenne X

41 Sensibilité : LOD et LOQ Définition : o la limite de détection (LOD) est la plus petite concentration de lanalyte pouvant être détectée et différencier du bruit de fond. En général, elle est évaluée à 3 x le bruit de fond du signal. o la limite de quantification (LOQ) est la plus petite concentration de lanalyte pouvant être quantifiée avec une exactitude et une précision appropriée. LOD Domaine danalyse : LOD LOQ Non détectable Domaine détectable Domaine quantifiable Mesure de la LOD : Injection de six blancs matrices et mesure de la réponse Calcul de la concentration en retour moyenne x 3 = LOD Mesure de la LOQ : Injection de 5 points de LOQ et calcul des concentrations Critère dacceptabilité : CV < 20 % et exactitude entre 80 et 120 % 41

42 Stabilité Critère dacceptabilité : Il ny a pas de valeurs réglementaires Stabilité des solutions mères et filles Stabilité à cours terme Stabilité à long terme Cycle de congélation-décongélation Stabilité post – extraction On sautorise une variation de 15% On sautorise une variation de 5% La stabilité de léchantillon doit être évaluée à toutes les étapes précédent lanalyse. 42

43 Dosage en routine Chaque jour de dosage : 1 gamme + 2 séries de QC à trois niveaux de concentrations par jour. 1 série valide la gamme du jour et une série en fin de dosage valide les échantillons Critère dacceptation : 75% des points de la gamme doivent avoir une variation ± 15% par rapport à leur valeur nominale (sauf à la LOQ ± 20%) 2 QC sur 6 QC peuvent être au-delà de ±15% de variation (mais pas au même niveau de concentration) 43

44 E XEMPLE : E TUDE T OXICOLOGIQUE DU FIPRONIL 44 Fipronil : Insecticide à usage phytosanitaire ou vétérinaire Interdit en France en 2004 Métabolite principal : Fipronil sulfone (-SO 2 CF 3 ) Potentiel perturbateur endocrinien : Effet sur hormones thyroïdiennes Substance vétérinaire la plus commercialisés au monde Risque pour la santé humaine lié à lexposition au fipronil?

45 E XEMPLE : E TUDE T OXICOLOGIQUE DU FIPRONIL 45 Réponse biologique Profils de concentration Toxicodynamie Dose Toxicocinétique Evaluer les effets du fipronil et de son métabolite sur les hormones thyroïdiennes Objectif : Administration IV ou VO Fipronil Fipronil sulfone Solvant Rats THX + T3 (SC) Cathétérisés Protocole : Dosage Fipronil et métabolite par LC/MS IV : Paramètres TK (t 1/2, CL…) VO : Biodisponibilité Plasma 6 jours (IV) 9 jours (VO) 10 pts/cinétique Administration IP Thyroxine (T4) à chaque groupe Dosage T4 et métabolites par LC/MS Dosage T4 par RIA Plasma 24H 8 pts/cinétique Gavage 14 jours Fipronil Fipronil sulfone Solvant Réponse biologique : Clairance et métabolisme T4

46 46 E XEMPLE : E TUDE T OXICOLOGIQUE DU FIPRONIL A: voie intraveineuse B: voie orale Fipronil sulfone Fipronil Fipronil sulfone Résultats TK : F abs 1 quelque soit la molécule

47 A: T 4 totale B: T 4 libre * * ** 47 E XEMPLE : E TUDE T OXICOLOGIQUE DU FIPRONIL * P < 0.05 ** P < 0.01 * P < 0.05 ** P < 0.01 Résultats TD (dosage RIA) :

48 48 E XEMPLE : E TUDE T OXICOLOGIQUE DU FIPRONIL Résultats TD (dosage LC/MS) : Permet de doser la T4 et ses métabolites Temps (Hr) Concentrations plasmatiques (ng/mL) T4 T2 T3 Dernière SC T3 Modification du profil de la T4 et de ses métabolites en présence de Fipronil ou de Fipronil Sulfone Importance dévaluer les molécules mères mais aussi les métabolites formés


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