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Intérêts de limmunofluoresence et des méthodes moléculaires pour le diagnostic de pneumocystose.

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1 Intérêts de limmunofluoresence et des méthodes moléculaires pour le diagnostic de pneumocystose

2 - MGG - calcofluor - Gomori-Grocott - bleu de toluidine En particulier avec les prélèvements « pauvres » : expectorations ou patients non sidéens Méthodes par coloration

3 Immunofluorescence Lim, Applied microbiology, ech patients immunodéprimés clinique/radio suggérant PCP - crachats induits ou aspirations tracheales - IFD : Ac obtenus chez le lapin Clinique et/ou radio Nbre patients avec IFD +-total Très en faveur de PCP Suggestifs de PCP 8253 Négatifs (contrôles) 34750

4 Immunofluorescence Lim, Applied microbiology, 1974 Histologie (methenamine-silver sur biopsie) Nbre patients avec IFD +-total

5 Immunofluorescence Lim, Applied microbiology, 1974 bonne spécificité de la technique : pas de confusion possible gain de sensibilité p/t à la méthode de référence de lépoque ? (anapath.)

6 Immunofluorescence Milder, J. Clin. Microbiol., rats immunodéprimés par injections sc de cortisone 2/semaines. - sacrifice de 4 rats toutes les semaines * biopsie de poumon : Gomori-Grocott * LBA : Giemsa et IFI (Ac obtenus chez le lapin)

7 Immunofluorescence Milder, J. Clin. Microbiol., 1980

8 Immunofluorescence au moins aussi sensible que lhistologie pour le diagnostic très précoce de linfection. sensibilité très supérieure au Giemsa sur LBA pas de problème de spécificité.

9 Immunofluorescence Procop, J. Clin. Microbiol échantillons examinés (LBA ++). Diff-Quick, Gomori-Grocott, Calcofluor, Merifluor White ® (IFD) - echantillon considéré + si positif avec 2 techniques au moins. techniqueSensibilitéSpécificitéVPPVPN Diff-Quick Calcofluor Gomori IFD

10 Immunofluorescence Ng J. Clin Microbiol, ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % Ng J. Clin Microbiol, ech (VIH ou « à risque ») IFD : 97 % DQ : 90 % Halford, Cytopathology, ech IFD : 86 % Gomori-Grocott : 66 % Wolfson, J. Clin Microbiol, ech double aveugle IFD : 100% Giemsa : 65% Aslanzadeh, Infection, ech IFD : 100% CW : 57%

11 Immunofluorescence Elvin, BMJ, 1988 (abstract) 25 LBA VIH+ 43 IS VIH+ IFI : 19 + Gomori-Grocott : 17+ IF > Gomori Rigole, Pathol. Biol (abstract) 100 LBA ID IFD : 72 + Gomori-Grocott : 68 + Tuncer, Scand J Infect Dis (abstract) 30 IS ID IF : 8 + Giemsa et Gomori : 4 +

12 Immunofluorescence Lautenschlager, J Clin Microbiol, LBA ID IF : 86% Gomori-grocott : 81%

13 Aslanzadeh, Infection, 1996 : prélèvements respiratoires dont 58% VIH - IFD : 19+ dont 12 crachats, 1 crachat induit et 6 LBA (100%) CFW : 11+ dont 6 crachats et 5 LBA (57%) Gain de sensibilité avec lIF notamment pour les expectorations. Immunofluorescence

14 Cruciani Eur Respir J méta analyse : comparaison de lanalyse dun crachat induit par rapport au LBA (« gold standard ») chez les VIH+. colorations : 43 % - colorations : 43 % IF : 67 % (p<0.001) IF : 67 % (p<0.001) LIF est nettement plus sensible pour les crachats induits (VIH+). Immunofluorescence

15 Immunofluorescence Kovacs, N. Engl. J. Med (abstract) - 49 crachats induits de patients présentant une PCP (confirmée a posteriori compte tenu des colorations, la clinique, lévolution sous traitement) IFI : 92 % Bleu de toluidine : 80 % Diff-Quick : 76 %

16 Immunofluorescence Ng J. Clin Microbiol, ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % Evaluation des FP avec lIFI : 15 patients + uniquement avec IFI 3 patients PCP certaine (réponse au tt anti-Pj) 6 patients indéterminés 6 ont autre cause et nont pas été traités pour Pj Evaluation des FN avec toutes les méthodes : 77 patients – 57 Vrais négatifs 10 patients indéterminés 10 Faux négatifs (réponse au tt anti-Pj)

17 Immunofluorescence Ng J. Clin Microbiol, ech (VIH ou « à risque ») IFI : 90 % DQ : 73 % Gomori : 72% Bleu toluidine : 71 % MéthodeSensibilitéSpécificitéVPPVPN DQ GMS TBO IFI

18 Immunofluorescence Ng J. Clin Microbiol, ech (VIH ou « à risque ») IFD : 97 % DQ : 90 % MéthodeSensibilitéSpécificitéVPPVPN DQ IFD (Crachats induits – LBA)

19 Immunofluorescence difficulté de conclure en labsence de « gold standard » IF : bonne sensibilité, a priori supérieure à celle des techniques de coloration classique. Permet de « rattraper » certains cas. Intéressant en particulier pour les expectorationns deux techniques sont indispensables. FN de toutes les techniques FP de lIF décrite comme plus rapide dexecution (p/t Gomori) et surtout plus rapide et plus simple à lire. pas de problème de spécificité : Spécificité des Ac monoclonaux, et reconnaissance « facile » des kystes ?

20 Immunofluorescence

21 Une capacité de détection supérieure … Dilution des LBA : comparaison capacité de détection x 100 p/t Gomori (Ribes, J Clin Microbiol, 1997 ) x 1000 p/t IFD (Leigh et all, J Clin Pathol, 1993) PCR

22 Brancart, J Microbiol Methods 2005 (abstract) 53 LBA Giemsa et IFD : 8+ PCR : 24+ Arcenas, Diag Microbiol Infect Dis (abstract) 2006 Gain de sensibilité de 21% Spécificité. Ribes J Clin Microbiol, ech Gomori : 37+ PCR : 60+ Caliendo, J Clin Microbiol, ech Crachats induits : IF : 64 % PCR : 96 % Leibovitz, J Clin Microbiol, ech Crachats induits : Giemsa et GMS : 28 % PCR : 85 % PCR Une capacité de détection supérieure …

23 Khan, J Infect, 2000 (abstract) 46 ech IF : 2+ PCR : 11+ nPCR : 21+ Tamburrini J Med Microbiol, 1993 (abstract) 52 LBA IFD : 81% PCR : 100% PCR Une capacité de détection supérieure …

24 Caliendo, J Clin Microbiol, echLBA : IF et PCR : 100 % Leibovitz, J Clin Microbiol, ech LBA : Giemsa et GMS : 82 % PCR : 86 % PCR Une capacité de détection supérieure … … pas toujours …

25 Un certain nombre de Faux Neg de la PCR sont post-traitement. Leigh et all, J Clin Pathol, 1993 Mauvaise extraction de lADN Toutes les methodes ne se valent pas … (Lu, J Clin Microbiol, 1995) sensibilité de 6 méthodes PCR : 100%, 100%, 57%, 60%, 33%, 23% PCR Pourquoi PCR pas toujours à 100 % ?

26 Olsson, Clin Microbiol Infect, ech IF : sens 60% spé 97% VPP 88% VPN 86% PCR : sens 96% spe 59% VPP 52% VPN 100% PCR Une trop grande sensibilité ??

27 PCR Il existe un portage sain … Chez limmunodéprimé : 18% (Maskell, Thorax, 2003) Chez limmunocompétent : 12 à 20% (Maskell, Thorax, 2003 ; Medrano, Emerg Infect Dis, 2005 ; Sing, J Clin Microbiol, 2000) Pas toujours retrouvé : 0% (Nevez, Clin Infect Dis, 2005 ; Weig, J Clin Microbiol, 1997)

28 PCR Comment distinguer le portage de linfection par P. jiroveci ? Flori, J Med Microbiol, LBA de patients présentant des signes évoquant PCP « Gold standard » : clinique, épreuve thérapeutique … sensibilitéspécificitéVPPVPN Giemsa Gomori PCR RT PCR

29 PCR Comment distinguer le portage de linfection par P. jiroveci ? Flori, J Med Microbiol, 2004 Détermination de la concentration en ADN dans léchantillon : La PCR en temps réel, en permettant la quantification de lADN de léchantillon pourrait permettre un diagnostic biologique fiable.

30 PCR Les méthodes moléculaires ne sont pas à lheure actuelle de bonnes méthodes pour le diagnostic de la PCP : trop de faux positifs dus à une trop grande capacité de détection. autres utilisation possible : épidémio, screening des patients pouvant bénéficier dune prophylaxie, suivi de lefficacité du tt …


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