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05.03.20141 SDS-PAGE Protocole expérimental. 05.03.20142 1.1 Annoter le bouchon des microtubes de 1,5 mL avec le nom des échantillons de poissons. 1.

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1 SDS-PAGE Protocole expérimental

2 Annoter le bouchon des microtubes de 1,5 mL avec le nom des échantillons de poissons. 1. Préparation des échantillons

3 Ajouter 250 µL de tampon Laemmli dans chaque tube annoté. 1. Préparation des échantillons

4 Extraction des protéines 2.1Pour chaque échantillon, prélever 1 g de muscle du poisson et le transférer dans le microtube annoté correspondant.

5 Mélanger brièvement le tube au Vortex, puis incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. 2. Extraction des protéines

6 Extraction des protéines 2.3Transférer 18 µL de la solution tampon contenant lextrait protéique, dans un tube avec bouchon à vis annoté. Ne pas pipeter un morceau de poisson !

7 2.4Chauffer les échantillons de poisson et dactine-myosine pendant 5 min à 95°C °C 2. Extraction des protéines

8 3.1Couper le long de la ligne et sortir la plaque de gel Préparation des gels délectrophorèse

9 Préparation des gels délectrophorèse 3.2 Couper le film adhésif de la plaque de gel, le long de la ligne marquée, avec une lame de rasoir ou un scalpel, et enlever la bande inférieure.

10 Préparation de la cuve délectrophorèse 4.1 Mettre la plaque de gel dans le support à électrodes, avec la plus petite face vers lintérieur. Fermer lautre côté du compartiment à laide dune plaque de séparation ou dune autre plaque de gel. 4.2 Appuyer sur le support à électrodes pour fermer les deux leviers de la structure dassemblage. 4.3Placer lensemble du compartiment intérieur dans la mini-cuve. 4.4 Retirer le peigne.

11 Remplissage de la cuve avec le tampon 5.1Remplir le compartiment intérieur avec 140 mL du tampon délectrophorèse TGS. 5.2Remplir la mini-cuve avec 200 mL du tampon délectrophorèse TGS.

12 Chargement du gel - Les pistes de droite et gauche restent vides. - Les autres puits seront chargés avec : - 10 µL des étalons Kaléidoscope (KS) - 10 µL de létalon actine et myosine (AM) µL des échantillons (Noter lordre des dépôts sur le protocole !) -- P1 P2 P3 P4 P5 AM KS --

13 Réalisation de lélectrophorèse Fermer la cuve et commencer lélectrophorèse à 200 V. Arrêter lélectrophorèse quand le Bleu de Bromophénol a atteint lextrémité inférieure du gel (environ 25 minutes).

14 Démoulage du gel 8.1Sortir la structure dassemblage et vider le tampon (le tampon pourra être réutilisé!). 8.2Sortir la plaque de gel et la poser avec la petite face au dessus.

15 Démoulage du gel 8.3Couper le film adhésif le long des côtés de la plaque de gel.

16 Retirer la face supérieure de la plaque de gel, et la placer gel au dessus, dans un bac de coloration rempli deau. 9.2Sous leau, séparer le gel de la plaque. 9.3Remplacer leau par 70 mL de solution de bleu de Coomassie et laisser colorer pendant 1 heure. 9. Coloration du gel

17 Transparisation du gel 10.1 Après une heure, vider la solution de coloration Décolorer le gel sous un filet deau (jusquà ce que le fond du gel soit transparent).

18 Analyse du gel 11.1Repérer les différences entre les protéines musculaires des différentes espèces. 11.2Déterminer la masse moléculaire de deux protéines par piste à laide de la courbe détalonnage.


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