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Cag: Un T4SS peu orthodoxe Pathogénicité de H. pylori La virulence de H. pylori est basée sur un ensemble de mécanismes, dont un système de sécrétion.

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2 Cag: Un T4SS peu orthodoxe

3 Pathogénicité de H. pylori La virulence de H. pylori est basée sur un ensemble de mécanismes, dont un système de sécrétion de type IV.

4 Rappels sur les T4SS 3 sous-familles:

5 VirB/D4: un système modèle Rappels sur les T4SS

6 Reconnaissance des effecteurs à sécreter: A. tumefaciensVirBCter, charge + L. pneumophiliaIcm/DotCter B. henselaeVirB Cter, charge +, domaine additionnel H. pyloriCag???

7 Le T4SS Cag de H. pylori Codé par 18 gènes regroupés en un îlot de pathogénicité. 1 seul effecteur sécrété: CagA Appareillage de sécrétion: 14Facteurs de translocation: 4

8 Quels signaux sur la protéine CagA sont nécessaires à sa translocation?

9 Rôle du Nter et du Cter? Construction de fusion GFP-hemiCagA Infection de cellules AGS Microscopie à épifluorescence Pas de GFP dans les cellules AGS Expression dans H. pylori ΔcagA Peut être que la GFP est trop volumineuse pour le système Cag?

10 Rôle du Nter et du Cter? Même expérience chez H. pylori wt Observer leffet sur la sécrétion de CagA La moitié Cter de CagA porte les informations de recrutement au T4SS GFP-CagA bloque la sécrétion de CagA car la GFP obstrue le T4SS CagA-GFP ne bloque pas la sécrétion de CagA car il nest pas recruté au T4SS

11 Affiner le résultat précédent… Construction de variants de CagA raccourcis en Cter Expression dans H. pylori ΔcagA Infection de cellules AGS Lextrémité Cter de CagA contient des informations nécessaire à la translocation de type IV Une délétion des 20 aa Cter de CagA abolit la Tyr-phosphorylation in vivo mais pas in vitro. Les mutants de délétion ne sont donc pas injectés dans les cellules AGS In vivo In vitro

12 Comparaison avec dautres effecteurs de type IV Pas de motif conservé, présence de résidus Lysine potentiellement importants Mutation ponctuelle des lysines 1203 et 1208 La protéine CagA mutée est toujours sécrétée Les charges + du Cter ne sont pas nécessaires pour la sécrétion de CagA. CagAK1203L 1208I CagAK1203I 1208L

13 Echangeabilité des séquences Cter Ajout à CagAΔ20C de séquences Cter dautres protéines sécrétées par le T4SS Il existe bien un signal commun pour la sécrétion de type IV, mais celui de CagA ne repose pas sur la charge électrique de la région Cter.

14 Et la région Nter? Construction de variants de CagA raccourcis en Nter Les protéines présentant de petites délétions en Nter ne sont produites quen très petites quantités Construction de variants de CagA amputés de segments plus longs. Aucun des variants délétés en Nter nest Tyr-P in vivo, alors quils le sont in vitro. Ces variants ne sont donc pas injectés dans les cellules AGS La région Nter de CagA contient des informations nécessaires à la sécrétion par le T4SS

15 La protéine CagA de H. pylori présente des signaux nécessaires à sa sécrétion par le T4SS qui sont originaux par rapport aux autres effecteurs de type IV.

16 La versatilité des T4SS se reflète à la fois dans la diversité des effecteurs transportés et dans les différents mécanismes de reconnaissance de ces effecteurs. NC Nter (sec dépendant) ex: DotA L.pneumophilia Cter, charge + ex: VirD5 A.tumeaciens Entrée dans le T4SS via le périplasme Cter, hydrophobique ex: RalF L.pneumophilia Cter ex: CagA H.pylori Domaine Nter ex: CagA H.pylori Domaine Cter ex: Bep B.henselae

17 Malgré leur extrême variabilité, les extrémités Cter des différents effecteurs de type IV sont échangeables. Cela suggère quau moins une partie du mécanisme de reconnaissance est commune aux différentes espèces utilisant ce mécanisme de sécrétion. Étant donné la diversité des séquences mises en jeu, il est probable que le signal de translocation de type IV implique des caractéristiques structurelles (secondaires ou tertiaires).

18 La présence chez CagA dun domaine Nter nécessaire à la translocation par le T4SS a plusieurs explications possibles: CagA serait chaperonnée par une protéine se fixant en Nter (à linstar de VirE2 et de sa chaperonne VirE1). Stabilisation de la protéine lors de sa translocation Une translocation en 2 étapes, nécessitant dabord les signaux en Cter (reconnaissance et adressage au T4SS), puis ceux en Nter (translocation et traversée du pseudo-pilus)

19 On sait à présent que CagA porte des signaux de translocation situés à son extrémité Cter ainsi que dans sa région Nter. Par quels mécanismes CagA est elle adressée à la machinerie de sécrétion?

20 A lheure actuelle il est généralement supposé que la Coupling Protein serait capable de reconnaître les effecteurs à sécréter. cagβ: code pour une protéine homologue à VirD4 cagF: code pour une protéine qui interagit avec CagA Parmi les 4 gènes accessoires du PAI Cag on trouve notamment:

21 Importance de CagF pour la translocation de CagA Une souche ΔcagF ne sécrète plus CagA, mais induit toujours une réponse IL-8 cagF ne serait donc pas un composant du T4SS mais serait un facteur essentiel à la translocation de CagA? Utilisation de la souche P12: cause une réponse IL-8 partielle si il ny a pas sécrétion de CagA Étude de la réponse IL-8 de cellules AGS infectées par des mutants ΔcagF et ΔcagY de H. pylori P12 Les mutants ΔcagF et ΔcagA présentent un phénotype similaire.

22 Importance de CagF pour la translocation de CagA Étude de la translocation de CagA par les mutants ΔcagF CagF est un facteur nécessaire à la translocation de CagA

23 CagF est-elle co-sécrétée avec CagA? Construction de fusion GSK-CagF et GSK-CagA (le tag GSK est phosphorylé dans les cellules Eucaryotes). GSK-CagF nest pas phosphorylé in vivo, mais lest in vitro. Donc GSK-CagF nest pas injectée dans les cellules AGS. CagF nest pas co-sécrétée avec CagA.

24 Qui interagit avec CagA? Immunoprécipitation de CagA à partir de souches WT, ΔcagA, et ΔPAI-[cagA] La protéine qui co-précipite majoritairement avec CagA est CagF.

25 Qui interagit avec CagA? Étude de linteraction CagF-CagA dans les mutants ΔcagV; ΔcagI; ΔcagZ et Δcagβ Les délétions des facteurs de translocation ou déléments de la machinerie du T4SS ne semblent pas affecter la capacité de CagF à co-précipiter avec CagA. CagF est la protéine qui interagit majoritairement avec CagA, et ce indépendamment des autres éléments du PAI cag.

26 Localisation de CagF? Analyse du contenu des fractions cellulaires CagF semble être à la fois dans les phases membranaires et hydrosolubles. CagF solubilise dans les mêmes conditions que Cagα qui est une protéine associée à la membrane cytoplasmique. ComB8 (une protéine intégrale de membrane cytoplasmique) ne solubilise pas dans ces conditions.

27 Localisation de CagF? Observation au microscope confocal de H. pylori exprimant la fusion CagF-GFP CagF-GFP GFP CagF peut être trouvée dans le cytoplasme des cellules ou associé à la face cytoplasmique de la membrane interne.

28 Adressage de CagA à la membrane? Co-immunoprécipitation de CagA dans les différentes phases cellulaires: CagF ne co-purifie avec CagA que dans la phase membranaire. CagA est adressée à la membrane en labsence de CagF, et inversement CagF nest pas nécessaire à ladressage de CagA à la membrane interne. CagF est peut etre responsable de ladressage de CagA à la membrane?

29 Stoechiométrie de linteraction CagA-CagF? Les données réunies jusquici pointent vers une fonction de chaperonne pour CagF. Les chaperonnes des T3SS agissent généralement en dimères. CagF serait capable de former des dimères, en solution pure ou en interaction avec CagA

30 Zone dinteraction CagF-CagA? Construction de différents variants de CagA On teste ensuite linteraction de ces variants avec la protéine GST-CagF fixée sur des billes Glutathion-Sépharose (GST pulldown).

31 Zone dinteraction CagF-CagA? CagF se fixe à la partie Cter de CagA, entre les résidus 1019 et 1123

32 Adressage de CagA au T4SS Le domaine de liaison à CagF est il nécessaire au recrutement de CagA par le T4SS? Construction de fusion entre la GFP et le Cter de CagA. On cherche à observer lobstruction du T4SS par la GFP Seule la protéine de fusion portant la totalité du site de fixation de CagF bloque la sécrétion de CagA Le site de fixation de CagF est donc essentiel à ladressage de CagA à la machinerie de sécrétion de type IV.

33 Comme VirE2, la translocation de CagA par le T4SS nécessite la présence dune protéine chaperone-like. Plusieurs données indiquent que CagF remplis cette fonction: *Comme VirE1, CagF présente des caractéristiques proches de celles des chaperonnes de type III (PI acide; fort pourcentage dhélices α). *CagF est nécessaire à la translocation mais ne fait pas partie du mécanisme de sécrétion. *Comme la plupart des chaperonnes de type III, CagF est capable de former des homodimères en se fixant à CagA. *CagF aurait un rôle dans ladressage de CagA au T4SS.

34 Mais CagF présente aussi des caractéristiques originales: *CagF est une protéine associée à la membrane interne, alors que les chaperonnes (dont VirE1) sont cytosoliques. *VirE1 assure la stabilité de VirE2, alors que CagF na pas deffet sur la stabilité de CagA. La fonction exacte de CagF est encore inconnue: *CagF pourrait modifier la conformation de CagA afin de faciliter son transfert *CagF pourrait faciliter la reconnaissance du signal de translocation Cter *CagF pourrait recruter CagA au niveau de la machinerie de sécrétion

35 M.E M.I Modèle proposé CagACagF N C N N C


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