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Wartel Morgane - M2 MBVB Système de sécrétion de type II et Sécrétine.

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1 Wartel Morgane - M2 MBVB Système de sécrétion de type II et Sécrétine

2 La sécrétion Figure 1 Sécrétion chez les bactéries à Gram – MI : Membrane interne ME : Membrane externe Milieu extérieur Cytoplasme ME Périplasme MI 2

3 Les différents systèmes de sécrétion Figure 2 Les différents de systèmes de sécrétion 3 Büttner and Bonas, 2002 Type VI secretion system

4 Le système de sécrétion de type II Figure 3 Sécrétion en 2 étapes Milieu extérieur ME Périplasme MI Cytoplasme 2. Sécrétion 1. Exportation (SEC ou TAT) 4

5 Le système de sécrétion de type II Figure 4 Modèle dassemblage du TIISS 5 OM IM Filloux, 2004

6 Les sécrétines Les sécrétines sont des protéines qui forment de larges canaux dans la membrane externe Les sécrétines sont impliquées dans différents processus : - le système de sécrétion de type II - le système de sécrétion de type III - les pili de type IV - la sécrétion des bactériophages filamenteux 6

7 Les sécrétines Les sécrétines forment des complexes multimériques (12 à 15 SU) très stables. Figure 5 Monomère de sécrétine (A) ; Complexe de sécrétines (B) Les dimensions indiquées et le nombre de monomères (SU) présents dans le complexe final varient dun système à lautre 7 Bitter, 2003

8 8 Les sécrétines Quelques exemples de sécrétines PilQ chez N. meningitidis et M. xanthus OutD chez E. chrysanthemi PulD chez K. oxytoca Partie C terminale commune Partie N terminale variable TIISS Pili de type IV

9 La sécrétine PulD - protéine intégrale de la membrane externe de 68 Kda - possède un peptide signal en N-terminal - forme un dodécamère (12 SU) dans la membrane externe très stable - copurifie avec PulS Figure 6 Multimère de PulD 14 nm 7 nm 9

10 La sécrétine PulD PulS : chaperonne spécifique de PulD nécessaire pour la protection de PulD de la protéolyse nécessaire pour la localisation de PulD dans la membrane externe 10

11 PulD peut sinsérer dans la membrane externe si : elle est exportée dans le périplasme (via SEC) elle est localisée à la membrane externe grâce à PulS Rôle de PulS ? 11 La sécrétine PulD

12 Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Andreas Engel, Anthony P Pugsley, and Nicolas Bayan Novembre 2006, The EMBO Journal Bacterial outer membrane secretin PulD assembles and inserts into the inner membrane in the absence of its pilotin

13 - Domaine N : prolongements dans le périplasme ; contient le peptide signal (SEC) - Domaine C ( ) : région de la membrane externe obtenue par protéolyse limitée - Domaine S : site de liaison pour la chaperonne PulS Figure 8 Dodécamère de PulD En bleu: domaine C Figure 7 Schéma de PulD 13 N C Domaine CDomaine NDomaine S Périplasme Membrane externeLiaison PulS Introduction Chami M. et al, 2005

14 Introduction Etude de la multimérisation et linsertion dans la membrane de 2 formes de PulD : PulD : forme WT PulD-CS : domaines C et S fusionnés au peptide signal Expression dans lhôte hétérologue E. coli N C Domaine CDomaine S 14 N C Domaine CDomaine NDomaine S Périplasme Membrane externeLiaison PulS

15 Figure 9 Localisation des monomères de PulD et PulD-CS en présence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD) PulD-CS est principalement localisée dans la membrane externe en présence de PulS % de sucrose 60 % de sucrose Echantillon I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe

16 Figure 10 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD- CShis en présence de PulS (solubilisation des multimères avec ZW3-14, purification sur colonne de cobalt) : Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis PulD-CS forme un multimère 16 I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe

17 Figure 11 A: Microscopie électronique à transmission de PulD-CShis purifiées en présence de PulS B: Microscopie cryo-électronique du complexe PulDhis en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté C: Schéma dun multimère de PulD-CShis Comme PulD, PulD-CS forme un dodécamère localisé dans la membrane externe Le domaine N ninfluence ni la dodécamérisation, ni la localisation dans la membrane externe 14 nm 7 nm ABC 17 PulD-CShisPulD Chami M. et al, 2005 I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe

18 II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS Figure 12 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD-CShis en présence ou non de PulS : Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis PulD et PulD-CS forment des multimères en absence de PulS 18

19 Figure 13 Microscopie électronique à transmission (B; C; D) et cryo-électronique (A) A: PulDhis purifiées en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) B: PulDhis purifiées en absence de PulS C: PulD-CShis purifiées en présence de PulS D: PulD-CShis purifiées en absence de PulS Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté PulD et PulD-CS forment des dodécamères en absence de PulS 19 B PulDhis D PulD-CShisPulDhis + PulSPulD-CShis + PulS CA Chami M. et al, 2005 II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS

20 Figure 14 Localisation des multimères de PulD en absence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose Les multimères de PulD et PulD-CS sont localisés dans la membrane interne en absence de PulS PulD et PulD-CS ne forment pas dagrégats en absence de PulS % sucrose Membrane interneMembrane externe II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS

21 Figure 15 Microscopie électronique de vésicules de membrane internes de E. coli (purifiées à partir du gradient de sucrose) produisant PulD ( A ); ou PulD-CS ( B ) en absence de PulS. : Multimère de sécrétine Selon les auteurs, les vésicules de membrane interne portent des multimères de PulD ou PulD-CS 21 PulDPulD-CS III – En absence de PulS, PulD sinsère dans la membrane interne

22 Figure 16 Extraction de PulD-CShis, de PspA et SecG par différentes concentrations durée (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD, AC α-PspA, AC α-SecG) PspA: protéine périphérique de la membrane interne SecG: protéine intégrale de la membrane interne Selon les auteurs, PulD-CS et PulD se comportent comme des protéines intégrales de la membrane interne 22 Lurée permet de libérer les protéines périphériques de la membrane interne, mais pas les protéines intégrales de la membrane interne III – En absence de PulS, PulD sinsère dans la membrane interne

23 Définition de la réponse au choc phagique : Elle a lieu suite à la perméabilisation de la membrane interne d E. coli. Elle est caractérisée par une production massive de PspA. Figure 17 Les protéines de la membrane interne sont séparées par SDS-PAGE puis révélées avec des AC-anti PspA En labsence de PulS, il y a induction de la réponse au choc phagique 23 III – En absence de PulS, PulD sinsère dans la membrane interne

24 Figure 18 Induction de la production de PspA en présence de différentes formes de PulD, en absence de PulS (Western blot avec AC α-PulD et AC α-PspA) D640::TEV: forme efficacement des multimères D281::TEV et N533::TEV: ne forment pas de multimères La réponse au choc phagique est dépendante de la multimérisation de PulD Lensemble des résultats prouve quen absence de PulS, PulD et PulD-CS sinsèrent dans la membrane interne, et forment probablement un pore 24 III – En absence de PulS, PulD sinsère dans la membrane interne

25 PulD-CS est adressée à la membrane externe en présence de PulS PulD-CS forme des dodécamères « PulD-like » dans la membrane externe en présence de PulS La moitié C terminale de PulD (domaines C et S) est un module autonome pour la dodécamérisation et pour linsertion dans les membranes La moitié N terminale ninfluence pas ces 2 propriétés Quel est lintérêt davoir produit PulD-CS pour la suite de larticle ? 25 Discussion

26 PulS nest pas nécessaire pour la formation des dodécamères de PulD Le rôle de PulS est dempêcher la localisation des dodécamères de PulD dans la membrane interne En absence de PulS, les dodécamères de PulD sinsèrent dans la membrane interne car : - les vésicules de membrane interne contiennent des multimères de PulD - Le test à lurée suggère que PulD est une protéine intégrale de la membrane interne - Linduction de la réponse au choc phagique dans les cellules produisant PulD sans PulS est en accord avec la formation dun pore dans la membrane interne 26

27 PulD est une protéine de membrane externe qui peut sinsérer efficacement dans la membrane interne pour former un pore en absence de sa chaperonne 27

28 In Vitro Multimerization and Membrane Insertion of Bacterial Outer Membrane Secretin PulD Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Catherine Berrier, Alexandre Ghazi, Andreas Engel, Anthony P. Pugsley and Nicolas Bayan Juin 2008, JMB

29 Introduction 2 formes de PulD sont étudiées dans cet article : PulD : forme native sans le peptide signal PulD-CS : domaines C et S Expression dans lhôte hétérologue E. coli pour les expérience in vivo (en+ IPTG) N C Domaine CDomaine NDomaine S N C Domaine CDomaine S 29 Membrane externeLiaison PulSPériplasme

30 PulD et PulD-CS sont synthétisées in vivo et in vitro sans leur peptide signal Etude de linsertion de PulD et PulD-CS dans la membrane interne de bactéries et dans des liposomes artificiels Etude 2 autres sécrétines : - OutD de E. chrysanthemi, nécessite OutB (PulS-like) pour sa localisation dans la membrane externe - PilQ de N. meningitidis, nécessite PilW et Omp85 pour sa multimérisation et son insertion dans la membrane externe Introduction 30

31 I – Synthèse et multimérisation de PulD, OutD et PilQ sans leur peptide signal, in vivo 31 Figure 19 Synthèse in vivo de différentes sécrétines. Analyse par Western Blot. - : Sans traitement ; U : Traitement à lurée ; P : Traitement au phénol PulD et OutD pourraient multimériser in vivo en absence de leur peptide signal PilQ ne multimériserait pas in vivo en absence de son peptide signal La capacité de PulD, OutD et PilQ à multimériser est en accord avec leur toxicité Croissance en +IPTG Arrêt immédiat Arrêt au bout de 30 minutes Croissance normale (e) Croissance normale

32 II – Synthèse et multimérisation de PulD en présence de lipides, in vitro Figure 20 Synthèse in vitro de PulD et PulD-CS en présence de Brij-35 (1 et 2) ou de liposomes (3 et 4) (western blot avec AC α-PulD et AC α-PulD-CS) - : Pas de traitement; + : Traitement au phénol Le détergent Brij-35 inhibe la multimérisation de PulD in vitro Les liposomes semblent stimuler la formation de multimères de PulD in vitro 32

33 III – Les multimères de PulD sinsèrent dans des liposomes in vitro 33 Centrifugation à 23000g pendant 10 minutes Culot :- Liposomes - PulD et PulD-CS - GFP (protéine soluble) ? PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes

34 Figure 21 Localisation de PulD synthétisée in vitro en présence de liposomes par flottaison sur gradient de sucrose (Western blot avec AC α-PulD) Les liposomes marqués avec un colorant fluorescent flottent en haut du gradient (35% de sucrose) PulD et PulD-CS flottent en haut du gradient (35% de sucrose) Ceci suggèrent que les multimères de PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes GFP flotte en haut du gradient (35% de sucrose) 34 III – Les multimères de PulD sinsèrent dans des liposomes in vitro

35 Figure 22 Effet de lurée sur la sédimentation de PulD et PulD-CS synthétisée in vitro en présence de liposomes (traitement au phénol, analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie) - : Sans traitement; + : Traitement à lurée La GFP nest pas retrouvée dans le culot PulD et PulD-CS sont retrouvées dans le culot après le traitement à lurée PulD et PulD-CS seraient insérées les liposomes 35 Centrifugation 23000g 10 minutes Culot + Urée Centrifugation g 30 minutes Culot III – Les multimères de PulD sinsèrent dans des liposomes in vitro

36 36 PulD-CSPulD Figure 23 Analyse par microscopie électronique de PulD-CS (a) et PulD (b) synthétisées in vitro en présence de liposomes Multimère de sécrétine inséré dans le liposome Encadré: Multimère de sécrétine purifié avec ZW3-14 Vue de côté Vue du dessus On observe des multimères de PulD-CS et de PulD Les multimères de PulD-CS sont similaires aux multimères de PulD-CS extraits de membranes bactériennes PulD-CS sassemble en complexe dodécamérique dans les liposomes III – Les multimères de PulD sinsèrent dans des liposomes in vitro

37 Figure 24 Analyse par microscopie cryo-électronique de PulD-CS synthétisées in vitro en présence de liposomes Encadré: Image moyennée Selon les auteurs, la présence de multimères dans le périmètre du liposome suggère quils sont insérés dans la membrane 37 III – Les multimères de PulD sinsèrent dans des liposomes in vitro

38 Figure 25 a : Microscopie électronique de OutD synthétisée in vitro en présence de liposomes. : Multimère de OutD b : Synthèse in vitro de PilQ en présence de Brij-35 (+ Brij) ou de liposomes (+ Lip) (Western blot avec AC α-PilQ) Les multimères de OutD sont associés à la membrane des liposomes PilQ forme uniquement des monomères en présence de liposomes IV – Multimérisation de OutD et PilQ in vitro 38

39 In vivo et in vitro, PulD et OutD en absence de leur peptide signal, peuvent multimériser et sinsérer dans une bicouche lipidique In vivo et in vitro, PilQ en absence de son peptide signal, ne formerait pas de multimères en présence dune bicouche lipidique Ces résultats concordent avec le besoin ou non de facteur(s) additionnel(s) pour la multimérisation de la sécrétine et son insertion dans la membrane 39 Discussion

40 Utilisation dun système de transcription-traduction couplé in vitro qui permet en présence de liposomes de synthétiser, dassembler et dinsérer dans une membrane un complexe multimérique Linsertion des multimères de PulD dans les liposomes a été vérifiée par : - leur coflottaison dans un gradient de sucrose - leur résistance à lextraction par lurée - la microscopie électronique Les pores de sécrétines sont ouverts ou fermés in vitro ? 40

41 PulD a la capacité spontanée de multimériser et de sinsérer dans une bicouche lipidique PulS empêche linsertion spontanée des multimères de PulD dans la membrane interne La famille des sécrétines peut-être divisée en 2 sous-groupes : - Les sécrétines qui peuvent multimériser et sinsérer spontanément dans une membrane (PulD et OutD impliquées dans le TIISS) - Les sécrétines qui nécessitent un ou plusieurs partenaires pour multimériser et sinsérer dans une membrane (PilQ impliquée dans les pili de type IV) 41 Conclusion générale

42 Membrane interne Périplasme Membrane externe SEC PulD PulS LolA PulD PulS PulD LolB 5 : Multimérisation de PulD et insertion dans la membrane externe 4 : PulS se lie à LolB, libération de LolA 3 : Formation rapide dun complexe PulD-PulS-LolA 2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC 1 : Synthèse dans le cytoplasme En présence de PulS + LolA Pourquoi utilisation de la voie Lol ?

43 Membrane interne Périplasme Membrane externe SEC PulD PulS LolA PulD LolB PulS PulD : Multimérisation de PulD 7 : Insertion par défaut dans la membrane interne En absence de PulS + LolA

44 PulD a une voie de biogénèse différente des autres protéines intégrales de la membrane externe 44 Membrane interne Périplasme Membrane externe SEC PulS LolA PulD LolB PulS PulD Skp Omp85 Skp 5 : Multimérisation et insertion dans la membrane externe 4 : Prise en charge par le complexe Omp85 3 : Prise en charge par Skp et transport à travers le périplasme 2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC ou TAT 1 : Synthèse dans le cytoplasme + LolA

45 Localisation correcte de PulD « au dessus » du TIISS 45 Membrane interne Périplasme Membrane externe PulD PulE PulG ? PulF

46 Références Bayan N., Guilvout I., Pugsley A.P. - Secretins take shape 2006 Bitter W. – Secretins of Pseudomonas aruginosa : large holes in the outer membrane 2003 Filloux A. - The underlying mechanisms of type II protein secretion 2004 Büttner D., Bonas U. - Port of entry, the type III secretion translocon 2002 Chami M., Guilvout I., Gregorini M., Remigy H., Muller S.A., Valerio M., Engel A., Pugsley A.P., Bayan N. - Structural Insights into the Secretin PulD and Its Trypsin-resistant Core 2005 Cours de TAP de S. Bleves et R. Voulhoux


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