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IBS (CEA-CNRS-UJF) HPBP, un marqueur potentiel du risque vasculaire ?

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1 IBS (CEA-CNRS-UJF) HPBP, un marqueur potentiel du risque vasculaire ?

2 Rappels sur le transport des lipides et les maladies cardio-vasculaires

3 Les lipoprotéines Plusieurs catégories -chylomicrons -VLDL (Very Low Density Lipoprotein) -LDL (Low Density Lipoprotein) -HDL (High Density Lipoprotein) alias "bon cholesterol"

4 intestin foie acides gras cholestérol chylomicron TG CE TG CE cellule adipeuse ou muscle triglycérides Cholestérol triglycérides Cellule cholestérol acide gras cholestérol acide gras cholestérol HDL TG CE VLDL LDL Cycle des lipides

5 Lathérosclérose 1 ere cause de mortalité dans les pays à mode de vie occidentale Cest un dépôt de cholestérol et de phosphate de calcium qui bouche les artères Provoque linfarctus et la thrombose Le processus est encore mal connu mais implique les LDL oxydées qui sont captées par des macrophages

6 Découverte de la Human Phosphate Binding Protein (HPBP) Structure de HPBP R.Morales et al., Structure (2006) Essais de cristallisation de HPON1 à partir de lots HPON1 "purs" Plasmas fournis par le CTS Structure de HPON chimérique Harel et al., Nat. Struct Biol (2004)

7 HPBP est copurifiée avec la paraoxonase (HPON1) la paraoxonase (38-45 KDa) : - apoprotéine associée aux HDL - protéine hydrophobe - glycosylée - activité arylesterase et phosphotriesterase - hydrolyse les agents neurotoxiques (soman, sarin..) - la paraoxonase a un rôle antiathérogénique (Souris knock-out) Rôles physiologiques ?: Activité thiolactone : dégrade lhomocystèine Protège les LDL de loxydation …

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9 HPBP est associée avec HPON1 et elles ont la même masse moléculaire Gel bidimensionnel Seules des conditions drastiques ont permis de séparer HPBP et HPON1 On parvient à les séparer sur hydroxyapatite F. Renault et al., J Chrom B (2006) 45kDa 39kDa HPON1 HPBP Échangeur danion hydroxyapatite 39kDa 45kDa Immunoprécipitation

10 phosphate 2 ponts disulfures Structure SIRAS à 1.9 Å Dérivé coloré fournit par ML. Chesne-Seck

11 HPBP est similaire aux "Phosphate Solute Binding Proteins" associées aux transporteurs ABC Boucle 1 Boucle 2 Boucle 3 Boucle 4 HPBP E. coli PstS protein M. tuberculosis PstS1

12 Ions Peptides … Binding protein HPBP est la première "binding protein" détectée chez un eucaryote Schéma dun transporteur ABC

13 HPBP fixe le phosphate Avec 13 liaisons hydrogènes - affinité submicromolaire ( 32 P) - Spécificité entre phosphate et le sulfate (10 5 ) HPBP est le premier transporteur de phosphate caractérisé dans le plasma

14 La paraoxonase pure est un mulltimère Josse et al., JBC (2002) Loligomérisation du complexe paraoxonase-HPBP dépend de la concentration de phosphate et de calcium Cela confirme que HPBP est liée au mécanisme phosphocalcique Poster M. Elias

15 Localisation physiologique de HPBP sur la plupart des lipoprotéines Dans les cellules de foie et dintestin

16 HPBP PON Région hydrophobe HPBP est une apolipoprotéine hydrophobe

17 HPBP et génome HPBP na jamais été caractérisée ni prédite par les banques de données génomiques

18 Initialement HPBP (378 aa) a été séquencée par cristallographie (10% dambigüité) Puis vérifiée par spectrométrie de masse MS/MS (A. Van Dorsselaer). La complémentarité des deux techniques ont permis de séquencer complètement la protéine sans ambigüité. Séquençage de HPBP

19 Attribution à partir de densité

20 MALDI-MS spectrum of trypsin digest of HPBP

21 Ambiguities of the crystallographic sequencing Isosteric amino acids Difficult to discriminate C, N, and O at 1.9ÅDiscrimination using chemical neighborhood Very difficult: attribution not reliable : 50% Possible: attribution reliable: more than 70% Residues with similar electronic density shapes

22 Human DING proteins N-terminus: D I N G G G A T L P Q… ProteinOriginFunction Synovial stimulatory protein FibroblastsT lymphocyte proliferation Etiology of rheumatoid arthritis? Hirudin binding protein (leech thrombin inhibitor) FibroblastsCell proliferation Genistein binding protein (soybean isoflavone with oestrogen activity) Carcinoma cell culture medium Cell proliferation? Apoptosis? Proteolysis inducing factor receptor Muscles and liver (tumors) Activation of phospholipase A2 : proteasome activation (cachexia) Crystal (Ca oxalate) adhesion inhibitor (CAI) Kidney epithelial cellsInhibition of kidney stone adhesion to epithelial cells Phosphate binding protein (HPBP) Plasma (HDL)Involved in phosphocalcic mechanism ? Les protéines DING sont absentes des banques données Elles sont principalement caractérisée que par leurs extrémités N-term HPBP est la première DING séquencée complètement Il y au moins 3 protéines humaines absentes du génome séquencé

23 Autres DING protéines ProteinOriginFunctions Cotinine receptor (nicotine derivative) Rat: neuronesCotinine receptor Lipid-free polysaccharide- binding protein Turkey: air sac fluid Pathogen adhesion to epithelial cells: trigger of defense reactions? Hepatitis Virus binding protein Woodchuck plasma ? Macrophage C3R ligandCandida albicans Aspergillus nidulans C3R ligand : « hijacking » of complement system Germin-Like Protein (GLP) binding protein Tobacco? DING proteinHypericum perforatum (St.Johns wort) ? Inhibits HIV transcription and replication Les protéines DING semblent ubiquitaires chez les eucaryotes

24 Il existe des fragments de gènes de DING eucaryotes procaryotes Absence systématique de HPBP des banques de données nucléotidiques. Autre mystère : La très grande conservation des séquences partielles nucléotidiques entre des espèces très différentes. 97% didentité (sur 628 pb)

25 Les protéines DING sont liées à plusieurs pathologies Références

26 Rôles possibles de la HPBP Le phosphate est une molécule très importante impliquée dans de nombreux mécanismes biologiques. HPBP est principalement liée aux lipoprotéine HPBP fixe le phosphate HPBP est associée à HPON1. modulée par lenvironnement phosphocalcique HPBP est similaire à la CAI Inhibe la formation des calculs rénaux HPBP peut être impliquée dans les maladies liées à la phosphatémie telle que lathérosclérose

27 Mapping des anticorps polyclonaux

28 Mapping des anticorps monoclonaux Très utile pour dévelloper un ELISA "type sandwich" Etude des cohortes

29 HPBP et HPON1 un bio-épurateur Essentielle à la stabilité et la fonctionnalité du complexe paraoxonase-HPBP Un enjeu pour la prophylaxie et le traitement des intoxications par les agents neurotoxiques. Paraoxonase : bio-épurateur catalytique. (responsable de la résistance des mammifères face aux insecticides) La butyrylcholinesterase : épurateur stoechiométrique. Production U.S. Army (1 million de dose (200mg) par an) remplacera en 2007 la pyridostigmine. Production par chèvres transgéniques (Nexia). Co-exprimer HPON1 avec HPBP

30 Létude de cette nouvelle protéine : soulève des questions au niveau génétique de plus, elle pourrait avoir un intérêt au niveau médical (Maladies cardiovasculaires, arthrite, cancer, HIV). Lopportunité de travailler avec une protéine inconnue ouvre un large champs dinvestigation, autorisant tous les espoirs. Conclusions

31 Remerciements LCCP,IBS, Grenoble: R. Morales, P. Carpentier, J. Dupuis, C. Contreras, J.C. Fontecilla IBMP, Strasbourg: F. Bernier LCM, IBS, Grenoble: M.L. Chesne, R. Kahn, J. Vicat CRSSA Grenoble: D. Rochu, F. Renaud, P. Masson LBA, Nancy: M. Nicodeme LSMBO, Strasbourg: H. dimer, C. Schaefer, A. Van Dorsselaer FIP, LCM3B Et bien dautres ….


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