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Interaction between the Signaling Molecules WNT7a and SHH during Vertebrate Limb Development: Dorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning Yingzi.

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1 Interaction between the Signaling Molecules WNT7a and SHH during Vertebrate Limb Development: Dorsal Signals Regulate Anteroposterior Patterning Yingzi Yang and Lee Niswander. Cell, Vol 80, Issue 6, 24 March 1995, Pages M1 DI 2008/2009 TD Biologie du développement FRIEDEL Perrine ROMIER Maïté

2 Introduction

3 1. Le développement du bourgeon de membre de lembryon de poulet Développement des membres des vertébrés : étude approfondie chez le poulet. Système simple à manipuler. Gastrulation, rappel sur les feuillets germinatifs: -Ectoderme (couche externe) : épiderme, système nerveux, etc. -Mésoderme (couche intermédiaire) : cellules du sang, cœur, reins, tissus conjonctifs, etc. -Endoderme (couche interne) : paroi du tube digestif, organes annexes.

4 Le bourgeon de membre apparaît comme un renflement du mésoderme latéral. Antérieur Postérieur FGF family AER : Apical Ectodermal Ridge (Crête apicale ectodermique) ZPA : Zone of Polarising Activity (Zone dactivité polarisante) Ectoderme de surface PZ: Zone de progression

5 FGF family AER : contrôle la croissance proximo-distale (épaule doigts) en stimulant la prolifération des cellules du mésenchyme. ZPA : induit la polarité antéro-postérieure (chez lhomme : pouce auriculaire). Ectoderme de surface : signaux contrôlant laxe dorso-ventral (dos de la main paume). A Po Do V Di Pr Études moléculaires: - Fibroblaste growth factor family (FGF) Expression à lAER, induction des signaux pour le développement du membre (études expérimentales). FGF4: expériences in vivo. - Sonic Hedgehog (Shh) Expression Shh ARN dans ZPA. Expression ectopique (partie antérieure) Respécification des cellules SHH est un composant de la voie de signalisation de ZPA. - Gènes Wnt : impliqués dans beaucoup de processus de développement. (Drosophile homologue wingless requit pour lexpression de hh) Wnt7a : exprimé dans lectoderme dorsal. FGF family A Po Do V Di Pr

6 Wnt7a ? 3 1.Est-ce que les interactions entre FGF4 et SHH peuvent contrôler la localisation de la ZPA? 2.Les signaux de lectoderme dorsale sont-ils nécessaires pour lexpression de Shh (et donc pour la formation du squelette postérieure)? 3.WNT7a est-il le signal de lectoderme dorsale requis pour lexpression de Shh? Axe proximo-distalAxe antéro-postérieure FgF4Shh Mutuellement dépendant Expression régulée Contrôlent la localisation de ZPA ? 1 (AER)(ZPA) Signaux de lectoderme dorsal Nécessaires pour lexpression ? 2 Axe dorso-ventral (Ectoderme)

7 1 ère partie Les interactions entre FGF4 et SHH contrôlent-elles la localisation de la ZPA?

8 1. Régulation de lexpression de lARN Shh in vivo. Hybridation in situ de la quantité totale dARN avec une sonde Shh marquée à la digoxygenine ProximalDistal Antérieur Postérieur Bourgeon de laile de poulet. Stade 20 : expression de lARN Shh dans le mésenchyme postérieur selon laxe proximal-distal. Stades 24 à 26 : expression de lARN Shh restreinte dans la partie distal postérieur du bourgeon de membre près de la crête apicale. Restriction domaine Shh FGF4/crête apicale requis pour maintenir lexpression de Shh Shh non régulé dans cellules qui ont perdu linfluence de la crête apicale/FGF4. ?

9 Tester cette hypothèse: expression ectopique de FGF4. - Petite entaille paroi de lorganisme (postérieur/proximal). - Insertion de billes (acrylique et héparine) imprégnées de FGF4 (stades précoces et avancés). - Après 24h Analyse de lexpression Shh. ProximalDistal A P Contrôle (bille de PBS) Contrôle (sans bille) Stade 20 : expression Shh autour de la bille dans mésenchyme proximal. Stade : activation de lexpression Shh près des billes. (Différents niveaux dexpression stades différents, 26 : début formation du cartilage) Contrôles : pas dexpression ectopique de Shh. FGF4 induit lexpression de Shh

10 2. Induction dune ZPA ectopique dans le mésenchyme proximal postérieur. Expression normale de gènes potentiellement cibles de la ZPA (Bmp2, Bmp4 et Hoxd13) près du domaine endogène Shh. Traitement FGF4, domaine ectopique Shh (mésenchyme proximal postérieur), expression de ces gènes (données non montrées). Domaine Shh exogène (mésenchyme proximal postérieur) sans FGF4, pas dexpression de ces gènes. Un tissu proximal postérieur dans lequel Shh a été induit (FGF4) peut-il fonctionner comme une ZPA? ? Test réalisé: - Bille imprégnée de FGF4 insérée près de la paroi de lorganisme à différents stades. - Un morceau de tissu adjacent à la bille FGF4 est greffé sur le côté antérieur dun bourgeon hôte daile de poulet. - Observation de la formation du squelette « doublé ».

11 Activité de polarisation complète. Duplication complète des doigts. Induction dun taux élevé dARN Shh. Induction dun taux plus faible dARN Shh. Activité de polarisation plus faible. Production dun doigt en plus (2-2) (4 cas sur 9) (n=9) Contrôle : bille de PBS Aucune activité polarisante. (stade 24, n=4) Un tissu proximal postérieur dans lequel Shh a été induit (FGF4) peut fonctionner comme une ZPA.

12 Insertion bille FGF4 sans greffe, observation du squelette 7 jours après : Conséquence morphologique unique: Ulna plus épais (cubitus). - Insertion bille FGF4 - Greffe du mésenchyme de la ZP et de lectoderme dun bourgeon de membre stade 20 près de la bille. Expression ectopique ( * ): doigt 4 manque. (n=4) Contrôle : bille de PBS petite pièce de cartilage observée sans forme. La ZPA induite doit agir conjointement avec une ZP indifférenciée pour produire un membre complet.

13 Conclusion 1 ère partie FGF4 induit et régule lexpression de Shh. Les interactions entre FGF4 et SHH permettent la localisation de la ZPA. La ZPA doit agir conjointement avec une zone de progression indifférenciée pour lobtention dun membre complet et organisé.

14 2 ème partie Les signaux de lectoderme dorsal sont-ils nécessaires pour lexpression de Shh (et donc pour la formation du squelette postérieure)?

15 1. Lexpression ectopique de Shh et les signaux de lectoderme dorsal et ventral. ARN Shh : distribution non équitable autour de la bille FGF4. Expression de Shh restreinte (mésenchyme, surface de lectoderme). A. Bille FGF4 insérée dans le mésenchyme proximal postérieur (stade 24). Localisation dorsale de lexpression de Shh réponse différentielle du mésenchyme dorsal et ventral? B. Bille FGF4 : mésenchyme côté ventral. Bille PBS : mésenchyme côté dorsal. Expression Shh : mésenchyme dorsal. Les signaux de lectoderme dorsal sont-ils requis pour induire lexpression de Shh? ?

16 C. Élimination de lectoderme dorsal + bille FGF4 dans le mésenchyme proximal postérieur. Faible expression ectopique de Shh. (Contrairement au fort taux dexpression induit en présence dune bille FGF4 et de lectoderme intact) D. Élimination de lectoderme ventral. Effet mineur sur lexpression de Shh.

17 E. Élimination de lectoderme dorsal et ventral Expression de Shh non détectée. Des signaux de lectoderme dorsal sont requis conjointement avec FGF4 pour induire lexpression ectopique de Shh. Les signaux de lectoderme dorsal sont-ils requis pour lexpression endogène de Shh ? ?

18 2. Lexpression endogène de Shh et les signaux de lectoderme dorsal et ventral. A. Élimination de lectoderme dorsal. Expression endogène de Shh réduite en absence de lectoderme dorsal. B. Élimination de lectoderme ventral. Effet mineur de labsence de lectoderme ventral sur lexpression endogène de Shh.

19 Autres tests réalisés: - Élimination de lectoderme dorsal et ventral. Perturbation de la crête. - Effet de lélimination de lectoderme dorsal sur lactivité polarisante. Élimination de lectoderme dorsale ou non. + 24h : greffe de la partie postérieur distale (sans/avec lectoderme) sur le côté antérieur dun bourgeon de membre hôte. Observations : - avec ectoderme : forte polarité. - sans ectoderme : faible/absente polarité. Les signaux de lectoderme (principalement lectoderme dorsal) sont nécessaires pour maintenir lexpression endogène de Shh ainsi que lactivité polarisante.

20 Signaux de lectoderme + FGF4 sont requis pour lexpression ectopique et endogène de Shh. Signaux provenant essentiellement de lectoderme dorsal. Maintient de lactivité du mésenchyme postérieur. Conclusion 2 ème partie

21 3 ème partie Rôle de SHH

22 Ablation de l'ectoderme dorsal Absence de l'ulna et du doigt 4 Membre plus petit Diminution de SHH = > perte d'éléments squelettiques Importance de SHH

23 Sauvetage d'un embryon avec l'ajout de SHH ? Ablation de l'ectoderme dorsal + Ajout de cellules exprimant SHH présence de l'ulna et du doigt 4 Membre plus petit SHH est responsable de la présence et du développement d'éléments squelettiques postérieurs Action dose dépendante spécifique de SHH pour spécifier le destin cellulaire le long de l'axe antéropostérieur

24 Shh primordial pour le développement du squelette du membre antérieur comme postérieur. L'action de Shh est dose dépendante. Shh est à l'origine de la décision de spécialisation cellulaire. Conclusion 3 ème partie

25 4 ème partie Constats : - Wnt7a n'est exprimé que dans l'ectoderme dorsal, - Drosophile : wg requis pour lexpression de hh. Wnt7a est-il le signal nécessaire à l'ectoderme dorsal pour que ce dernier exprime Shh dans le membre?

26 1ère étape : Vérification de la dépendance de Wnt7a pour l'expression de Shh endogène Ablation de l'ectoderme dorsal et ajout ou non d'un groupe de cellules exprimant Wnt7a. Expression de Shh maintenue à taux normal seulement en présence de Wnt7a.

27 2nde étape : Influence de Wnt7a et FGF4 sur l'expression de Shh Ablation de l'ectoderme dorsal et de la crête apicale + Ajout de groupe de cellules exprimant Wnt7a et une source de FGF4 Expression de Shh maintenue à taux normal en présence de Wnt7a et FGF4.

28 Wnt7a ou FGF4 nont aucune action séparément, c'est leur coopération qui permet l'expression de Shh. Ablation de lectoderme dorsal et de la crête apicale Contrôles FgF4FgF4 + îlot cellulaire non transfecté

29 3ème étape : Influence de Wnt7a sur l'expression ectopique de Shh Ablation de l'ectoderme dorsal + Ajout d'une source de Wnt7a (rétrovirus ou groupe de cellules) et une source de FGF4 RetrovirusGroupe de cellules Expression de Shh dans une zone proche de la source de FGF4. Vue postérieure

30 4ème étape : Rôle de Wnt7a sur le développement squelettique des membres postérieurs Ablation de l'ectoderme dorsal + Source de Wnt7a Présence de l'ulna et du doigt 4 = >Wnt7a peut reconstituer la formation des membres antéropostérieurs. Membre plus petit = > Wnt7a ne peut pas corriger la réduction de taille de ces membres.

31 Wnt7a et FGF4 sont nécessaires pour maintenir le taux d'expression de Shh à des valeurs normales. Wnt7a est responsable du développement du squelette des membres antérieurs et postérieurs. Wnt7a permet la présence du squelette mais ne régit pas sa croissance en elle même. Conclusion 4 ème partie Remarque : Shh dépend de la coopération entre Wnt7a et des signaux de la crête apicale (FGF4).

32 Discussion

33 Axes de développement d'un membre : - proximo-distal = > crête apicale - antéro-postérieur = > mésenchyme postérieur - dorso-ventral = > ectoderme dorsal Il existe une coopération entre les trois unités responsables de cette croissance, et donc une interaction entre les signaux Wnt7a, FGF4 et SHH : Shh est contrôlé par la production de FGF4 par la crête. Les signaux de l'ectoderme dorsal coopèrent avec FGF4 dans la régulation de Shh. Wnt7a peut remplacer le signal de l'ectoderme dorsal nécessaire pour l'expression de Shh. La résultante des différents signaux constituent la ZPA : l'activité de cette zone exige des signaux des trois zones de synthèse : la crête, le mésenchyme postérieur et l'ectoderme dorsal. C'est dans l'interaction complexe de ces produits de gène que la ZPA trouve son identité.

34 Modèle d'interaction proposé

35 Les molécules de signalisation Wnt, FGF et Shh sont exprimées partout dans beaucoup de stade de développement embryonnaire. La compréhension de leurs interactions et les gènes qu'ils contrôlent en aval devraient fournir une connaissance plus grande de leur action de coordination pour un certain nombre de processus liés au développement (structures neurales, organisation de la structure axial de l'embryon...). Ouverture


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