Les échantillons biologiques sont de taille variée

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1 Les échantillons biologiques sont de taille variée

2 Les outils d'observation
L'infiniment petit 1 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 homme fourmi cellule molécule protéine atome noyau de l'atome Les outils d'observation collisionneur de particules CERN rayonnement synchrotron rayons X L'œil microscope Pus on veut voir petit, plus l'instrument est grand

3 Soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions
Principe : Soumettre le système à une excitation et étudier ses réactions Système à étudier e.g. solution aqueuse, cristal Signaux ‘émis’ par le système sous l’effet de la ‘sonde’ e.g. Transmission Diffusion à ‘grands’ angles ‘Sonde’ e.g. faisceau de lumière Rayons IR : Spectro Infra rouge Champ radiofréquence + champ magnétique : RMN Ionisation + champs E et B : spectro de masse Lumière polarise: dichroïsme circulaire Rayons X : diffraction X Neutrons, électrons Contiennent de l’information sur les caractéristiques du système

4 La lumière: onde électromagnétique
une oscillation couplée du champ électrique et du champ magnétique qui se propage Le champs électrique E et le champs magnétique H sont perpendiculaires Dans le vide la lumière se propage à la vitesse C= km/s Une onde est caractérisée par sa fréquence u (période T=1/u ) L’énergie E=hu (h cste de Plank: js) Sa longueur d’onde l=C.T=C/u L’amplitude et la direction (polarisation) du champs électrique

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6 Absorption de la lumière
La matière n'absorbe la lumière que si la lumière a une énergie égale à une transition électronique. EF EF E hn=EF-EI Ei Ei Cette transition est très rapide 10-15s

7 Absorption des rayons X
Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome hn hn=EF-EI Cela demande une grande énergie rayons X EI EF

8 En dehors des seuils A=k Z3 l3 L'absorption des rayons X est proportionnelle au nombre d'électron. Plus la longueur d'onde est petite, moins les rayons X sont absorbés (loin des seuils). C'est pour cella que les rayons X sont "transparent" les éléments sont lourds (Z) sont plus absorbés Ex Os (Ca, P), Pb Les tissus (C,O,N) sont transparents Application radiographie

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10 L'absorption: la loi de Berr-Lambert
L'absorption de la lumière est dépendante de: -la longueur d'onde (transition électronique) - de la nature chromophore e(l) -la concentration (ou densité), C -la longueur du chemin optique parcouru dx Io It L La perte d'intensité pour un petit élément d'épaisseur dx On intègre sur l'épaisseur L L'intensité transmise décroit de façon exponentiel en fonction de la largeur de la cuve et de la concentration. C'est la loi de Beer-Lambert

11 la transmitance (souvent exprimée en %)
On note le rapport La Densité optique (D.O) ou l'aborsbance A est Plus la densité optique est forte plus la solution absorbe La couleur Si une solution absorbe une couleur (longueur d'onde), la solution apparaitra avec sa couleur complémentaire. Un solution qui absorbe le bleu apparaitra orange te vice versa

12 Le spectrophotomètre UV-Visible
C'est un des appareil les plus utilisé en laboratoire Cuve de référence principe IO It Source polychromatique. Lampe à incandescence visible Lampe à Xénon (UV) Monochromateur Permet de sélectionner la longueur d'onde Tampon + échantillon

13 Le monochromateur est constitué soit d'un prisme soit d'un réseau
Le prisme permet de disperser la lumière selon sa longueur d'onde Avec un réseau La cuve est souvent standard avec une largeur de 1 cm Le coefficient d'extinction molaire [e]=mol-1. cm-1 On trouve des cuves de différent volume de 50ml à 1ml. Elle peuvent être en plastique, en verre et en quartz. Il faut utiliser les cuves en quartz pour les mesure dans l'UV

14 A la fin on représente A=log(IO/It) en fonction de la longueur d'onde
Ou bien l'absorption à une longueur d'onde (en fonction du temps) Ex absorption à 340 nm pour suivre la formation du NADH A t

15 Spectrophotomètre Avantages:
- Méthode simple - Précise - sensible - Nécessite peu de matériel (50 ml) - Non destructive

16 L'absorption dans l'UV-Visible
l'absorption UV-Visible implique de transition de niveau électronique de valence La liaisons chimique implique le partage d'électron à des niveaux énergétique plus bas E=hn

17 Effectivement la gaz rare ne font pas liaisons
H2 H H s* anti liante 1S 1S s liante Ex H2 Ex He2 1 liaison liante 1 liaison antiliante Pas de liaison Effectivement la gaz rare ne font pas liaisons

18 Les autres orbitales de valence

19 Combustion, oxydation des aliments, respiration,…
Orbital P Ex O2 8 électrons liants 4 électrons antiliants =>2 liaisons (reste 2 doublets non liant sur chaque atome) C'est à cause des électrons non appariés que le dioxygène est si réactif. Combustion, oxydation des aliments, respiration,…

20 O O simplification s* P* Px Py n n n n Pz Px Py Pz Px 2S 2S
Doublet non liant s Orbital P P n n O O S n n P

21 Résumé des transitions possible dans les couches de valence
La plupart du temps ces transitions seront responsables de l'absorption de la lumière dans la gamme de l'ultraviolet. C'est la raison pour laquelle les UV sont capables de casser les liaisons chimiques, de former des radicaux libre En biologie on s'intéresse principalement au transition PP* (Intense et UV-visible) En pratique on s'intéresse à la gamme 200nm-800nm

22 Les systèmes conjugués
Lorsque les orbitales P sont alignées, les électrons peuvent se déplacer d'une orbitale à l'autre. Les électrons sont délocalisés. Ex benzene Dans ce cas, il y a un effet stabilisateurs. L'énergie des orbitales baisse et le gape avec l'orbitale P* non liante diminue. Plus le système est conjugué plus cette effet est marqué P*d Plus le système est conjugué plus la longueur d'onde d'absorption sera grande. Grâce à cette propriété les chromophores peuvent absorber jusqu'au visible P*d Pd Pd

23 Les indicateurs colorés de pH.
Les indicateurs colorés sont des systèmes conjugués qui absorbent dans le visible. Le changement de pH change la conjugaisons du système. Les longueurs d'onde absorbées ne sont plus les même, le système change de couleurs Ex phénolphtaléine Devient rose déprotonés à pH basique (>10) certains pigments de fleurs: anthocyanidines On retrouve ces pigments dans les fraise, le raisin, les mures,…

24 .N Ex de chromophore biologique La liaison peptidique O O- C Ca Ca C
Absorption UV à 190nm Transition PP* O. O- C. Ca Ca C. Ca Ca N .N H

25 Certains acides aminés
Trp, Phe, tyr sont des systèmes conjuguès

26 L'absorption UV à 280 nM permet de déterminer la concentration de protéine. L'absorption est proportionnel à la concentration Loi de Beer Lambert : A=el l C Il faut connaître son coefficient d'extinction molaire el (expérimentale ou théorique à partir de la séquence). L'absorption UV à 280 nM permet aussi de suivre les protéines (qui sont transparentes à l'œil) par exemple lors d'une purification

27 Les bases d'ADN ou d'ARN Adénine Guanine Thymine cytosine A cause de leurs systèmes de conjugaisons, ces bases absorbe dans l'UV. L'ADN et L'ARN absorbe à 260nm (280 nM pour les protéine) L'absorption UV à 260 nM permet aussi de suivre les l'ADN ou l'ARN

28 Dimère de thymine Sous l'effet de radiations non-ionisantes (UV solaires ...), la thymine (tout comme la cytosine) peut former un dimère covalent. Un dimère consiste en deux bases adjacentes qui, sur le même brin d'ADN, font une double liaison. Une double liaison covalente empêche l'ADN polymérase d'effectuer la réplication de la cellule. Généralement la mort cellulaire ou le cancer s'en suivent lorsque non réparées par les enzymes. Le Xeroderma pigmentosum est notamment causée par ce dérèglement génétique. Cette liaison atypique entre les bases est réparé par le système NER (nucleotide excision repair).

29 Certain cofacteurs Le carotène Le système est fortement conjugué, le carotène absorbe le bleu. Par conséquent il apparait orange. Astaxanthine  La crustacyanine est une protéine qu'on retrouve dans la carapace des crustacés. 2 monomères type tonneaux b (Lipocaline). Elle fixe astaxanthine qui est responsable de la coloration des homards La protéine fixe un pigment l'astaxanthine Qui est très conjugué. il absorbe le bleu d’où la couleur rouge

30 Quand on chauffe le homard, il change de couleur
C'est à cause de la dénaturation de la crustacyanine. Dans la protéine native, le pigment est courbé. L'environnent du pigment lié (liaisons hydrogène) sera différent du pigment libre. Il absorbe le rouge d’où la couleur bleu Dans la protéine dénaturé, le pigment retrouvera une géométrie et un environnement similaire au pigment libre. Il absorbera dans le bleu, d’où la couleur rouge 1GKA

31 Le Nicotinamide Adénine Dinucléotide (NAD) est un coenzyme d'oxydoréduction
Le NAD est capable de fixer 2 électron et un proton, soit un ion hydrure H- En fixant l'électron et le proton la résonance du cycle. On change donc les longueur d'absorption En suivant l'absorbance à 340 nm, on pourra suivre l'évolution de la réaction enzymatique. Formation de NADH (réduction) ou disparition de NAD+ (Oxydation)

32 1HSO 1 monomère d'alcool déshydrogénase. On voit le cofacteur fixe par le sandwich triple aba avec la topologie "Rossman fold" Dans le foie cette enzyme catalyse l'oxydation de l'alcool en aldéhyde OH O CH2 + NAD+ CH3 CH + NADH + H+ CH3 Le jeunes filles expriment moins d'alcool dehydrogenase que les jeunes hommes et sont par conséquent plus sensible à l'alcool Les asiatiques ont une d'alcool dehydrogenase moins performante que les européen et sont par conséquent plus sensible à l'alcool

33 O OH + NAD+ + NADH + H+ CH2 CH CH3 CH3
L'absorbation à 340 nm permet de suivre la réaction au cours du temps, cinétique enzymatique [P] Vitesse initiale t Phase préstationnaire Phase stationnaire Effet du produit équilibre

34 Autres cofacteurs NADP Les cofacteurs flaviniques (FAD, FMN) dérivés de la vitamine B2 (riboflavine) jaune rouge Sans couleurs

35 Coenzymes quinoniques
Ex ubiquinone (coenzyme Q10) Production d'énergie dans la mitochondrie Et lutte contre le stress oxydant

36 Les cycles porphyrines: hème et chlorophylle
Le cycle porphyrine est très délocalisé, il absorbe donc dans le visible. La nature du métal ou son etat d'oxydation change les propriété d'absorbation. Sang oxygéné rouge, sang hypoxique bleu Structure ?

37 Changement de couleur par clivage
La phosphatase alcaline catalyse l'hydrolyse du para-nitrophénolphosphate : Architecture sandwich triple (aba) 2 Zn, 1 Mg 1ALK Hydrolysé, ce substrat devient jaune et absorbe à 405 nM. Cette propriété est très utilisé en biologie (ELISA)

38 La couleur par la diffusion Rayleigh
On peut avoir de la couleur sans pigment (sans absorption). Le ciel est bleu est pourtant il n'y a pas de pigment bleu Diffusion de Rayleigh Diffusion de mie

39 micro onde saut d'un niveau de rotation Infrarouge saut d'un niveau de vibration Visible saut d'un niveau électronique dans une  orbitale moléculaire délocalisée Ultraviolet proche saut d'un niveau électronique dans un orbitale moléculaire   ,  ou formation d'un radical libre si liaison    Rayon X     Extraction des électrons des couches électroniques de l'atome.

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41 Les métaux de transitions

42 Radio X Fluo BET, cristaux