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Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la souris.

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1 Déterminisme du Sexe et la compensation de dose chez la souris

2 Gametogenèse, compensation de dose, empreintes génomiques, souris mutantes- t,déterminisme de sexe

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4 Le sexe est déterminé par le gonade XX:développement des ovaires système Mullerian organes génitaux femelle XY:développement des testicules Système Wolffian organes génitaux mâle Enlève les gonades avant que le sexe soit déterminé: -chez les souris XX et XY développement du système Mullerian Greffe dun testicule à coté dune ovaire à 12 jours: -Wolffian développe et le Mullerian disparaît. Donc: Lovaire nest pas essentiel pour le développement du système Mullerian -Le testicule est essentiel pour le développement du Système Wolffian -Le testicule produit une molécule qui inhibe le développement du système Mullerian

5 Développement mâle et femelle

6 Zfy et Sxr A Oxford en 1971 ils ont trouvé une souris sex-reversed: Sxr XX mais mâle à cause dune translocation Cherchez dans cette région pour le gène commutateur Page et al: ont trouvé un gène Zfy -zinc finger facteur de transcription Par Southern blot ils ont détecté deux bandes: une séquence sur le chromosome X et lautre sur le chromosome Y???? 3 explications: -allèles X et Y sont des sous-unités dune protéine -allèle X est non fonctionnel -inactivation du chromosome X chez la femelle donne un seul allèle actif chez le femelle, deux chez la mâle BUT: Zfy nest pas exprimé dans les testicules des souris Steel…donc cest pas le bon candidat.

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8 Quels sont les cibles de Sry Sry se fixent sur une séquence de 6/7 nucléotides ( AACAAT oligonucléotide sélection). Cherchez des gènes qui sexpriment après Sry et où la séquence de 6/7 nucléotides est présente dans le promoteur. Sox 9 ( 20 gènes Sox chez la souris: important pendant le développement: SrybOX) Souris transgènique: Sry promoteur+myc. Regarde lexpression de la protéine MYC et lexpression de la protéine SOX9. MYC ensuite MYC+SOX9 ensuite SOX9 Conclusion: Sry gène est transcrit pour une période courte et la protéine SRY active le promoteur du gène SOX9. SOX9 peut changer le sexe dune souris. SRY peut probablement activer le gène AMH ( anti-Mullerian hormone) dégénération des structures femelles Sox3: inhibiteur du gène Sox9???

9 Expression de la protéine SRY

10 Régulation de lexpression du gène Sry WT1=Wilms Tumour Gene: +/- KTS ( +/- lysine threonine serine dans un des doigts à zinc qui se fixe sur lADN)

11 Sry/SRY murine et humain Peu de conservation en dehors de la boîte HMG Murine protéine tronquée ne fonctionne plus Protéine humaine fonctionne chez la souris Lactivité de SRY dépend de son état de phosphorylation?

12 Un gène pour le développement femelle? La majorité des XY femelles nont pas de mutation dans le gène Sry. La duplication dun gène sur le chromosome X-Dax1-peut donner des XY femelles Dax-1 sexprime dans les même cellules que Sry, au même moment mais lexpression continue après Sur-exprime Dax-1 chez M.musculus musculus: pas deffet Sur-exprime chez M.musculus poschiavinus ( allèle faible de Sry) faible changement dans les gonades. Plus probable que le rôle de Dax-1 est dempêcher le développement mâle chez la femelle intéraction avec SF1, molécule essentiel pour le développement mâle.

13 Rôle de Sox3 ? >100 XX mâle où Sry ne sexprime pas Beaucoup plus probable quil sagit dune inhibiteur de lexpression de Sry qui est muté quun gain-of function. Modèle: SOX9 est essentiel pour devenir mâle SOX3 peut inhiber Sox9 femelle SRY peut inhiber Sox3 Donc SRY et SOX3 sont des inhibiteurs et pas des activateurs?

14 Lexpression de Sry dans le cerveau Testosterone est central pour le développement du comportement mâle SRY est produite dans les même cellules qui produisent tyrosine hydroxylase synthèse de dopamine Anti-sens oligonucléotides inhibition de SRY empêche la fonction des cellules essentielles dans les fonctions moteurs chez le rat Chez la femelle les oestrogens peuvent assurer la fonction de SRY De plus….. Sry peut agir comme facteur dépissage Les transcrits de Sry sont parfois circulaire et non-fonctionnels

15 Role du gène Foxl2 Mutations dans ce gène empêche le développement de lovaire et sont associées avec XX sex-reversal Absence de lexpression de Foxl2 change le développement de 2 linéages: Les granulosa cells Sertoli like Les theca cells ( synthèse des steroids) synthetisent le précurseur de la testosterone Rôle de Foxl2: réprime lexpression de Sox9 dans lovaire Foxl2 fonctionne avec le récepteur de loestrogen ( ce qui explique en partie le sex reversal associé avec des problèmes des hormones)

16 Lactivation de Sox9 est inhibe par lexpression de FOXL2 a) TESCO ( Testis specific enhancer of Sox9) active un gène rapporteur dans le testis mais pas dans lovaire c) Par ChiP FOXL2 peut se fixer sur la séquence TESCO d) FOXL2 peut reprimer lexpression dun gène rapporteur sous le contrôle de TESCO

17 Model of Sox9 Regulation Required for Maintenance of Gonadal Phenotype in Mammals Cell 139,

18 DMRT1 Double-sex and Mab3-related transcription factor 1 Nature 476: delete Dmrt1 FoxL2 expression testis become ovaries

19 Tortoiseshell cat/ Ecaille de tortue

20 X-linked diseases a

21 Linactivation du chromosome X pendant la vie dune souris a

22 Linactivation aléatoire du chromosome X chez la femelle Lembryon a reçu un allèle normal et un allèle mutant de ses parents. Dans le cas où la mutation désavantage les cellules, ces cellules peuvent être éliminé et donc le résultat de linactivation est biaisé.

23 Le gène Xist Xic ( X Inactivation Center ) identifié par les translocations Cherchez un gène dans cette région qui sexprime uniquement à partir du chromosome X inactif Xist: X Inactive chromosome Specific Transcript: 17kb, pas de cadre ouverte de lecture, toujours dans le noyau, jamais dans les polyribosomes Pas dexpression chez les mâles Présent dans plusieurs espèces différents

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25 Conservation des séquences dans les gènes Xist: les A repeats (1) sont le plus conservées ainsi que la région 4. Les transcrits Xist sans les A repeats ne fonctionnent plus ( les transcrits sont localisés sur le chromosome en cis mais sans inactiver). H=human M=mouse R,A,T,K= 4 compagnoles (voles)

26 La région Xic: a) 5 ARN non-codantes sont détectés: b) Xist sexprime au début à partir des 2 X chez les cellules femelles et ensuite un des deux X montre une forte expression

27 Le gène Tsix Délétion de 65kb dans le région 3 du Xist. Le chromosome X avec cette délétion est toujours inactivé Dans cette région on trouve la région 5 dun gène Tsix transcrit dans lautre sens de Xist Xist Chr X Tsix Xic

28 Plusieurs allèles de Xic Les allèles plus ou moins forts de Xic existe: a

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30 Histone Code

31 Modifications des histones du gène Xist

32 Xist inactivation complèxe

33 Etapes moléculaires pendant linactivation du chromosome X

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35 Counting chromosomes….la suite Tel Cen Xist Tsix Délétion 5Tsix (a) /------/ Tr 5Tsix (b) Souris a) toujours le X avec la délétion inactivé: site du blocking factor Souris b) Si cette région contient le site pour le blocking factor, ce transgène devrait éponger le factor-- X-inactivation chez le male. On ne voit pas cela. On ne trouve pas les transcrits du gène Xist sur le transgène ou le chromosome X. Souris a) homozygous: la moitié des cellules meurent: les cellules inactivent soit un, soit deux chromosomes X. Chaotique.

36 Counting Chromosomes Blocking factor produit par les autosomes un chromosome X est protégé contre linactivation Competence Factor produit par les chromosomes X et il faut deux doses pour inactiver

37 Les étapes principaux pendant linactivation du chromosome X

38 Les séquences LINE Les transcrits du gène Xist sont essentiels pour linactivation: cest pas juste lactivation du promoteur et une changement dans la chromatine transcrits Xist par cellule: pas suffisant pour couvrir tout le chromosome. Le chromosome X est riche en séquences LINE ( Long Interspersed Nuclear Elements). Présent aussi sur les autres chromosomes. Les transcrits Xist se fixent sur les séquences LINE: un complexe se forme qui change la conformation du chromosome dans un région autour de ce complexe

39 Linactivation du chromosome X pendant le développement de la souris

40 Gènes qui echappent à linactivation chez lHomme: Beaucoup moins échappent chez la souris: pas de centromère? Les gènes qui échappent chez lhomme ont peut être une fonction spécifique aux femmes? Certains gènes peuvent être inactivé et ensuite réactivé XO chez lhomme et chez la souris?

41 X-Escapées 15% des gènes sur le X échappent chez lhomme 3% échappent chez la souris Les gènes qui échappent ont une expression souvent moins important que la copie sur le X actif Chez lhomme les éscapées sont dans les blocs Chez la souris ils sont isolés et dans la chromatine silencieux Chez lhomme les gènes qui échappent sont variables selon lindividuel et selon le tissu Les gènes qui échappent peuvent être réactivé

42 Escapées…la suite Les études sur les gènes qui échappent sont importants pour comprendre le mécanisme moléculaire de linactivation. Pas de ARN Xist sur les éscapées Moins de séquence LINE Moins de motif AT rich qui sont aussi associés avec linactivation Moins de méthylation des histones, plus dacetylation CTCF: protéine qui peut isoler les séquences. CTCF se fixe sur la chromatine entre un gène qui sexprime et un gène qui est inactivé chez la souris: chez lhomme les 2 gènes sont inactivés et CTCF ne se lie pas.

43 …..et fin Les gènes qui sont impliqués dans les différences entre les femelles et les mâles sont très présents sur le X: plutôt les gènes activé par les hormones. Souris XY KO pour Sry avec Sry transgène sur un autosome (XY-Sry) ( donc Y-=Y moins le Sry). On va avoir des cellules avec le chromosome Y sans ou avec le transgène Sry. Croisement avec femelle XX 4 possibilités XY-Sry x XX XXSry (mâle) XX (femelle) XY- (femelle) XY-Sry (mâle) XX Sry ( mâle) et XY- Sry (mâle) sont différents ( comportement, expression des gènes) La majorité des gènes qui échappent chez la souris et la femme ont une fonction dans le cerveau. Trisomy XXX: 1/1000 Problèmes comportement variable chez les femmes

44 The X in sex: how autoimmune diseases revolve around sex chromosomes ….the predominance of affected women, and perhaps its most intriguing putative mechanism is related to sex chromosomes, based on the recent observation that women with autoimmune diseases manifest a higher rate of circulating leukocytes with a single X chromosome. Haploinsufficiency???

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46 Modèle pour expliquer comment des gènes peuvent échapper à linactivation

47 Linactivation du chromosome X est différente dans les espèces différentes

48 Quelques observations en plus……. Les méthodes utilisé dans les cellules humaines et les cellules murines sont probablement différentes…. Rôle du Tsix moins clair chez lhomme: les transcrits sont tronqués ou parfois absent Rôle possible des RNAi: une hybridation entre les transcrits Xist et Tsix donne une molécule double brin qui est clivée par Dicer: les RNAi sont supposés contrôler linactivation. KO pour Dicer pas dinactivation et léthale chez les femelles.


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