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Vectorologie Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs dexpression de gènes Etienne Decroly, CNRS

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Présentation au sujet: "Vectorologie Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs dexpression de gènes Etienne Decroly, CNRS"— Transcription de la présentation:

1 Vectorologie Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs dexpression de gènes Etienne Decroly, CNRS

2 Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs dexpression de gènes Les virus constituent des systèmes dexpression spécialisés Question ? Peut-on les utiliser pour exprimer selon nos besoins des protéines dintérêt dans une cellule cible? Oui, les virus sont à lorigine de plusieurs systèmes dexpression utilisés à ce jour Thérapies génique biotechnologies Exemples : phage display vecteurs dexpression viraux vaccination

3 Vecteurs viraux courants (eucaryotes) Vecteurs réplicatifs –Vecteurs se répliquant de manière autonome Pas d utilisation en thérapie génique Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à l échelle industrielle, vaccinologie et expression des protéines Exemples : Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères, tropisme large Baculovirus : cellules d insectes, expression très élevée ! Vecteurs dérivés non réplicatifs en cellules mammifères Vecteurs non réplicatifs –Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant les gènes essentiels à la réplication délétés dans la construction du vecteur : « packaging cell lines » –Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique –Exemples : Adénoviraux : Ad2 & Ad5 Rétroviraux : MLV, lentiviraux( HIV) Adéno associés : famille des parvovirus Alphavirus : SFV Efficacité Ciblage Problèmes liés aux ADN nus :

4 Caractéristiques recherchées pour un vecteur viral (thérapie génique) Ciblage et Expression Sécurité Production Tropisme cellulaire adaptable (choix des enveloppes virales) Régulation de la transcription possible (choix des promoteurs) Stabilité dexpression (intégration ou épisomes, immunogénicité faible) Matériel génétique inséré de grande taille (de 3 à 100kb) Recombinaison faible voir absente Toxicité faible (immunogénicité faible, intégration dirigée) Réponse immunitaire faible (expression minimum de gènes viraux) « Packaging cell lines » aisément cultivables Production de virus à hauts titres infectieux

5 Comment construire un virus recombinant réplicatif ? Identifier un gène non essentiel à la réplication, ou conditionnellement nécessaire Remplacer ce gène non essentiel par le « trans gène » (TG)

6 Poxvirus : cycle du virus de la vaccine Cycle entièrement cytoplasmique Virus ADN double-brin linéaire (200 kb) Infection de tout type cellulaire mammifère et aviaire (sauf CHO) 10% des protéines totales de la cellule sont des protéines de la vaccine

7 Construction de virus recombinants Le gène codant pour la protéine tymidine Kinase (TK) nest pas essentiel à linfection virale dans des cellules en division Principe : Introduire le TG par recombinaison homologue dans le gène TK Transfection Noyau Cellules Mammifères Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Virus de la vaccine Recombinant (TK-/TG+) + virus WT (99,9%) pro MCS Transgène Séquences du gène TK pro Promoteur Vaccine 5 3 Choix du promoteur (précoce ou tardif) Virus de la vaccine Infection

8 Sélection et purification des virus recombinants Cest létape limitante : Sélection des virus TK- : en présence de BrdU (5-bromodéoxyuridine), la TK phosphoryle le BrdU qui est incorporé dans le génome viral (létal) sélection en incorporant un gène de résistance aux antibiotiques ou le gène lacZ (blanc bleu) Purification des virus : Par dilution limite (plage de lyse) Plusieurs cycles nécessaires Contrôle de lexpression des TG PCR Western Blot

9 Avantages et limitations du système vaccine Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères Constructions de virus recombinants : Construction du plasmide difficile (recombinaison) Choix possible du promoteur (précoce ou tardif, fort ou faible) Sélection des virus recombinants et purification longues Production de stocks de virus recombinants facile Inconvénients Les virus WT et recombinants sont infectieux et immunogène pour l homme (yeux) Ce sont des virus infectieux… (L2 ou L3) utiliser la souche Ankara MVA atténuée La vaccine perturbe les métabolismes cellulaires : Expression des protéines endogènes Effet cytopathique : les cellules infectées meurent 48 h après infection Infecte seulement les cellules en division Avantages Niveau dexpression élevé Modifications post-traductionnelles ad-hoc (glycosylation, clivages protéolytiques) Taille des inserts > 20kb Production aisée de titres infectieux (10 10 PFU/ml) Choix du promoteur (précoce ou tardif) Ancien vecteur de choix pour les vaccinations Transcription cytoplasmique (pas de problème d export des ARNm, pas d épissage)

10 Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (1) Construction dun virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol Transfection Noyau Cellules Mammifères pro T7pol 5 3 Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Sélection et purification de virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol Virus de la Vaccine (WT) Infection

11 Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (2) Expression de gènes sous le contrôle de la T7 polymérase : Avantages/Inconvénients Expression aisée de multiples constructions La transfection est une étape limitante pour les productions industrielles Transcription cytoplasmique (pas de problème d export des ARNm, pas d épissage) 1. Construction dun plasmide T7 polymérase exprimée par le VV ARNm Protéines 2. Transfection Noyau pro TG pro MCS Transgène Promoteur T7 Pol pro VV: T7 Pol 3. Infection

12 pH dépendante Phases tardives Phases très tardives Baculovirus Virus ADN double-brin circulaire (130Kb) arthropodes (lépidoptères, SF9) Polyhédrine nécessaire pour linfection dun nouvel hôte

13 Formation de baculovirus recombinants Particularités de la polyhédrine : Niveau d expression très élevé (jusquà 50% du total cellulaire) Protéines non essentielles à la propagation de l infection Les virus recombinants polyhédrine ont une morphologie identifiable dans la cellule recombinaison homologue dans le gène de la polyhédrine. Baculovirus 3. Infection 2. Transfection Noyau Cellules SF9, SF 21 Recombinaison homologue 0,1 à 0,5% Baculovirus recombinant pro MCS Transgène Séquences baculovirales polyhédrine pro Promoteur polyhédrine 1. clonage

14 Vecteurs baculoviraux commerciaux 99% de recombinants

15 Avantages et limitations des vecteurs baculoviraux Utilisation principale : expression de protéines en cellules dinsectes, vaccins recombinants, production de protéines insolubles en bactéries. Avantages Promoteur très fort, niveau dexpression élevé Modifications post-traductionelles proches du système mammifère Glycosylations : high-mannose mais pas hybride et complexes Transport et processing ad-hoc Taille des inserts > 50kb Production aisée de titres infectieux (10 10 PFU/ml) Pas d infection possible de l homme (restriction au niveau de la transcription) Inconvénients Virus lytique (chez l insecte) La formation des virus recombinants est une étape limitante

16 Vecteurs de deuxième génération pour thérapie génique Le baculovirus est capable dinfecter des cellules mammifères (récepteur présent) Toutefois ces gènes ne sont pas transcrits L activation des unités transcriptionelles est restreinte aux cellules dinsectes L intégration dun transgène (TG) en aval dun promoteur eucaryote permet l expression du TG Avantages Production aisée de hauts titres infectieux Tropisme large (récepteurs inconnus) Pas de réplication ni de production de protéines virales chez lhôte Survie des cellules infectées (virus lytique chez l insecte) Insert de grande taille (50 kb) et choix possible des promoteurs Risque de recombinaison très faible « Packaging cell lines » : pas de construction complexe (SF9) Inconvénients Pas d intégration, persistance limitée Non déterminé Réponse immunitaire ? Infection des cellules quiescentes? Song SU, Boyce FM. Exp Mol Med. (2001) Mar 31;33(1):46


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