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Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae Journal of Bacteriology (2009) Lybarger et al Bressuire Christelle.

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1 Docking and Assembly of the Type II Secretion Complex of Vibrio cholerae Journal of Bacteriology (2009) Lybarger et al Bressuire Christelle

2 INTRODUCTION Le Système de sécrétion de type II - Mécanisme en 2 étapes -Translocation MI via Sec ou Tat - Machinerie complexe similaire machinerie dassemblage Pili type IV -Translocation ME de la conformation repliée

3 -Bacille incurvé Gram – - Responsable du cholera - Sécrétion de toxine et de facteurs de virulence par SST2 Vibrio cholerae INTRODUCTION

4 Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

5 Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

6 Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

7 Comment sassemble le SST2 dans la paroi de Vibrio cholerae ? Modèle du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae INTRODUCTION

8 Interactions protéine-protéine du SST2 C Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine

9 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 GspC GspD Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine C

10 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 GspC GspD Gsp C GspM et GspL Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine C

11 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 Assemblage du SST2 ? Etude interactions protéine-protéine GspC GspD Gsp C GspM et GspL EpsL EpsM C

12 INTRODUCTION Interactions protéine-protéine du SST2 Etude de lassemblage du SST2 de Vibrio cholerae Etude des interactions protéine-protéine de EpsC et EpsM Suivit des protéines GFP-EpsC et GFP- EpsM in vivo C Protéine GFP (Green Fluorescent Protein)

13 Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) Localisation polaire de GFP-EpsM GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit nest pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca

14 Directed polar secretion of protease from single cells of Vibrio cholerae via the type II secretion Pathway. Scott et al. PNAS (2001) Green fluorescent chimeras indicate nonpolar localization of pullulanase secreton components PulL and PulM. Buddelmeijer et al. J. Bacteriol (2006) Localisation polaire de GFP-EpsM GFP-EpsM localisé aux pôles de la bactérie Vibrio cholerae GFP-PulM non surproduit nest pas localisé aux pôles de la bactérie Klebsiella Oxytoca La localisation polaire de GFP-EpsM est-elle due à la surproduction de la protéine?

15 Localisation de GFP-EpsM ? Souche Vibrio cholerae epsM + pGfp-EpsM

16 Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence Induction à lIPTG Localisation des protéines GFP-EpsM aux pôles de la bactérie C

17 Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence Sans induction à lIPTG Localisation des protéines GFP-EpsM à la périphérie de la membrane C

18 Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence + IPTG- IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à linduction à lIPTG

19 Localisation de GFP-EpsM ? Observation au microscope à fluorescence + IPTG- IPTG La Localisation polaire de GFP-EpsM est due à la surproduction de la protéine. Artefact !!!

20 Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localiseés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduites alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines?

21 Hypothèse 1 ou 2? Souche Vibrio cholerae Gfp-EpsM

22 Souche Vibrio cholerae epsM + pGfp-EpsM Promoteur eps = Protéine GFP-EpsM produite en adéquation avec les autres protéines Eps Promoteur Inductible = Protéine GFP-EpsM peut être produite à un niveau différent de celui des autres protéine Eps Hypothèse 1 ou 2? CC

23 Localisation protéines GFP-EpsC et GFP-EpsM Localisation protéine native EpsC ou EpsM ? SST2 assure la sécrétion des toxines de Vibrio cholerae ? C Protéine GFP-Eps = Protéine native Eps?

24 Vérification production protéine de fusion par Western-Blot Détection de protéine GFP-EpsC Détection protéine GFP-EpsM Protéine GFP –EpsM instable ? Cross reactive band ?

25 Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? BOC Methylcoumarin fluorescent Induction IPTG protéaseVC1200

26 Le SST2 des souches GFP-EpsC et GFP-EpsM est il toujours fonctionnelle ? Linsertion de la fusion GFP nempêche pas le fonctionnement du SST2

27 Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Protéine de fusion localisé dans la membrane de Vibrio cholerae et non aux pôles Observation au microscope à fluorescence

28 Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines?

29 Surproduction des protéines GFP-EpsM les protéines GFP-EpsM sont localisés aux pôles de la bactérie Hypothèse 1: la surproduction des protéines GFP-EpsM Hypothèse 2: les protéines GFP-EpsM sont surproduit alors que les autres protéines du SST2 ne le sont pas C Localisation polaire de GFP-EpsM= Surproduction protéines? La stœchiométrie des protéines de fusion et des autre Eps est nécessaire à la localisation des protéines de fusions

30 Localisation des protéines de fusion GFP-EpsC et GFP-EpsM Points de fluorescence= SST2 assemblé ? Observation au microscope à fluorescence

31 Point de fluorescence = SST2 assemblé? Dispersion de la fluorescence Compétition Protéine native Eps / Protéine GFP-Eps Point de fluorescence = SST2 assemblé C Observation au microscope à fluorescence

32 Vérification de limportance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines Souche Vibrio cholerae PBAD Remplacement epsC et epsM par leur version fusionnée gfp-epsM et gfp-epsC sous le contrôle du promoteur pbad inductible à larabinose. Maintien équilibre des éléments Eps du T2SS C

33 Vérification de limportance du maintien de la stœchiométrie des Eps pour la localisation des protéines

34 Maintien de la stœchiométrie naturelle de chacun des composants du SST2 = Pré requis pour détermination de la localisation cellulaire

35 Observation au microscope à fluorescence

36 Le nombre de point de fluorescence augmente avec le niveau dinduction à larabinose Observation au microscope à fluorescence

37 Corrélation Points de fluorescence/Sécrétion protéase du SST2?

38 Les points de fluorescence représentent un SST2 fonctionnelle

39 Localisation protéine EpsG par immunofluorescence Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ?

40 Auto- fluorescence Points de fluorescence

41 Localisation protéine GFP-EpsC et Eps= Localisation protéine native EpsC et EpsM ? Points de fluorescence la localisation des protéines de fusion est représentatif des protéines natives Auto- fluorescence

42 Assemblage du Système de sécrétion de type II

43 Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB nest pas nécessaire à lapparition des points de fluorescence

44 Ancrage du système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae Rôle filaments cytosquelette MreB ? MreB nest pas nécessaire à lapparition des points de fluorescence Lactivité du SST2 ne dépend pas de MreB MreB nintervient pas dans larrimage du SST2

45 Interactions protéine-protéine entre GFP-Eps et les autres Eps Rôle des autres protéines Eps dans la localisation de EpsC et EpsM? Délétions des autres gènes Eps Observation de leffet de la délétion: -Sur lexpression des gènes gfp-EpsC et gfp-EpsM - Sur lactivité du SST2 - Sur la localisation des protéines de fusion GFP- EpsC et GfP-EpsM C

46 Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur le niveau dexpression?

47 La délétion depsD espL et epsM entraine une surproduction des autres protéines Eps Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ?

48 Sur le niveau dexpression? Augmentation de la production des protéines Eps non due à la fusion GFP Hypothèse: Absence Eps D, EpsL ou EpsM SST2 non fonctionnelle Suractivation du promoteur eps (facteur σ E ) Augmentation de la production des autres protéines Eps Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? C

49 Sur lactivité du SST2?

50 Effet de la délétion des gènes epsD, espL et epsM ? Sur lactivité du SST2? La Délétion des gènes epsD, espL et epsM empêche la sécrétion de protéase par le SST2

51 Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence

52 Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsC? Dispersion de la fluorescence La localisation de EpsC semblerait dépendre dEpsD

53 Souche Vibrio cholerae PBAD::gfp-espC Délétion epsD gfp-epsC sous le contrôle du promoteur eps inductible à larabinose Empêche la surproduction des protéines EpsC due à la délétion depsD C Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion depsD?

54 Dispersion de la fluorescence Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion depsD?

55 Dispersion de la fluorescence EpsD à un rôle crucial dans la localisation de EpsC Dispersion de fluorescence= Surproduction protéine GFP-EpsC suite à la délétion depsD?

56 Effet de la délétion des gènes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules Délétions nempêchent pas la formation des points de fluorescence

57 Effet de la délétion des gènes epsL et epsM? Sur la localisation de EpsC? Délétions nempêchent pas la formation des points de fluorescence Plus de points de fluorescence aux pôles des cellules EpsM et EpsC sembleraient maintenir EpsC au niveau de la membrane latérale

58 Interactions EpsL et EpsM Moins de protéine EpsL en absence d EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases

59 Interactions EpsL et EpsM Moins de protéine EpsL en absence d EpsM et inversement Effet accrue en phase stationnaire due au nombreuses protéases Effet de protection mutuelle dans linteraction EpsL/EpsM

60 Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Cellules plus courtes mais même points de fluorescence Localisation de GFP- EpsC aux pôles de la cellules et dans le cytoplasme

61 Effet de la phase stationnaire sur la localisation de GFP-EpsC Restauration des points de fluorescence après complémentions des gènes epsL et epsM délétés Hypothèse: EpsC est sujet à la protéolyse en labsence dEpsM et EpsL EpsL-EpsM stabilisent EpsC dans une conformation nécessaire à sa localisation dans la membrane latérale

62 Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence

63 Effet de la délétion des gènes epsD? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence EpsD est nécessaire à la localisation dEpsM

64 Effet de la délétion des gènes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complémentation

65 Effet de la délétion des gènes epsL et epsC? Sur la localisation de EpsM? Dispersion de la fluorescence Restauration des points de fluorescence par complémentation EpsC et EpsL sont nécessaire à la localisation dEpsM

66 Co-localisation de mCherry-EpsC and GFP-EpsM? mCherry-EpsC GFP-EpsM mCherry-EpsC + GFP-EpsM Points jaunes = SST2 assemblé ?

67 Conclusion Localisation non polaire du SST2 mais tout au long de la membrane = artefact due à la surproduction des protéines Eps. Importance du respect de la stœchiométrie naturelle des éléments du SST2 pour lobservation de leur localisation. Technique de fusion des protéines Eps au GFP permet létude des interactions directement au sein du SST2. Relations entre les Eps mise en évidence: -EpsD est nécessaire à la localisation dEpsC -EpsM/EpsL assurent le maintien dEpsC à la membrane latérale -EpsD, EpsC et EpsL permettent la localisation dEpsM Modèle de lassemblage du Système de sécrétion de type II de Vibrio cholerae

68 Modèle de lassemblage du SST2

69

70

71

72 Merci pour votre attention


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