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Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement Luc Paillard CNRS UMR 6061 Faculté de médecine Université Rennes.

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2 Régulations post-transcriptionnelles de l'expression génétique au cours du développement Luc Paillard CNRS UMR 6061 Faculté de médecine Université Rennes 1

3 Introduction Place des régulations post-transcriptionnelles Fonctions cellulaires Activité des protéines Activité "spécifique" (phosphorylations…) Concentrations Dégradation Traduction TraductibilitéConcentration d'ARNm Dégradation des ARNm Synthèse TranscriptionMaturation

4 Introduction Maturation des ARNm eucaryotes ADN ARN prémessager Transcription 5' Ajout de coiffe (Cap) 7m G-PPP-N Excision des introns Epissage des exons Exon 1Exon 2Exon 3 Intron 2Intron 1 Ajout dune queue poly(A) à lextrémité 3 5'

5 Introduction Structure des ARNm eucaryotes AAAA…AAA 5'3' Coiffe (Cap) 7m G-PPP-N AUGSTOP Région 5' non codante (5'UTR) Région 3' non codante (3'UTR) Phase codante Queue poly(A) Après lépissage des exons!

6 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants 1. Epissages différentiels et développement 2. Traduction, stabilité et état dadénylation

7 1. Epissages différentiels et développement Exon 1Exon 2Exon 3 5' Exon 3Exon 4 Exons alternatifs Situation 1 Situation 2

8 1. Epissages différentiels et développement Exon 1Exon 2Exon 3 5' Exon 3Exon 4 Exon 1Exon 2Exon 3 5' Exon 4 Saut dexon Et beaucoup dautres possibilités… Situation 1 Situation 2 Situation 1 Situation 2 Exons alternatifs

9 1. Epissages différentiels et développement Lexemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile Gène sex-lethal : transcription sous le contrôle de facteurs de transcription activiteurs et inhibiteurs Activateurs produits par le chromosome X Inhibiteurs produits par des autosomes Femelles XX : activateurs>inhibiteursSynthèse sxl Male XY activateurs

10 1. Epissages différentiels et développement Lexemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine sxl contrôle lépissage alternatif de transformer Femelle : sxl sxl STOP Protéine tra active STOP Male : pas de sxl Protéine tra tronquée : inactive

11 1. Epissages différentiels et développement Lexemple de la différenciation sexuelle chez la drosophile La protéine tra contrôle lépissage alternatif de doublesex Femelle : tra actif tra Male : tra inactif Protéine dsx a un exon en plus chez la femelle que chez le male Même activité de liaison à lADN, mais effets différents sur la transcription

12 Extrait (œuf ou embryon) ARN Northern blotFraction A- Fraction A+ Oligo(dT) cellulose Northern blot Centrifugation sur gradient de saccharose Polysomes (traduit) Monosomes (non traduit) Northern blot 2. Traduction, stabilité et état dadénylation Lexemple du développement précoce du xénope

13 Northern blot 1. Electrophorèse des ARN Gel d'agarose 2. Transfert sur membrane Membrane de nylon 3. Hybridation avec une sonde radioactive complémentaire d'un ARN Sonde radiomarquée hybridée 4. Autoradiographie Le film photo est impressionné par la radioactivité

14 Etat d'adénylation et traduction Paris et Philippe (1990) Dev Biol 140, 221 Corrélation état A+ et traduction, état A- et absence de traduction

15 Stimulation traductionnelle Répression traductionnelle Stable Traduit Non traduit Instable en général Stable chez le xénope jusqu à la MBT Polyadénylation Désadénylation AA..AA CADRE DE LECTURE Les variations de longueur de la queue poly(A) régulent l'expression génétique

16 Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (1) Certains ARNm sont polyadénylés pendant la maturation ovocytaire Mais quest-ce que la maturation ovocytaire? -Méiose (PI à MII) - Pas de transcription - Peut être faite in vitro (progestérone)

17 Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (2) Alignement des séquences d'ARNm polyadénylés pendant la maturation ovocytaire McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803

18 Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (3) Test de la séquence : principe A0 A+ t0t0 t1t1 A0 A+ t0t0 t1t1 ARN polyadénylé pendant l'incubation ARN non polyadénylé pendant l'incubation Injection d'ARN synthétisés in vitro, radiomarqués, contenant ou non la séquence à tester Extraction des ARN après incubation (en présence ou non de Pg) Électrophorèse, autoradiographie

19 Recherche d'éléments contrôlant la polyadénylation cytoplasmique (4) Test de la séquence : Résultats McGrew et al. (1989) Genes Dev 3, 803 Une séquence non spécifique (AAUAAA) et une séquence spécifique sont nécessaires à la polyadénylation cytoplasmique La séquence spécifique a été appelée CPE (Cytoplasmic Polyadenylation Element)

20 Régulation de la polyadénylation dépendante du CPE Identification de la CPEB (CPE Binding protein) Modèle :- Le CPE lie la CPEB - La CPEB provoque la polyadénylation des ARNm auxquels elle est liée Pourtant : - La CPEB est présente dès le début de l'ovogenèse...

21 Régulation de l'activité de la CPEB B. Pendant la maturation ovocytaire Progesterone CPEB P CPE AAA…AAA 3' + 5' Eg2 protein Traduction A. Dans l'ovocyte non maturé CPEB CPE 3'5' Pas de traduction

22 Fonction de la polyadénylation contrôlée par la CPEB Linjection danticorps anti CPEB bloque la maturation ovocytaire Identification de certains ARNm dont la polyadénylation est nécessaire à la maturation (c-mos…)

23 Mais ce nest pas tout! Souris dont le gène CPEB est inactivé… Fonction dans le fonctionnement neuronal

24 Et les désadénylations?

25 Contrôles aberrants de létat dadénylation des ARNm et pathologies humaines Exemple 1 L'ARNm -globine est très stable pendant la différenciation érythrocytaire Cette stabilité lui est conférée par un élément de séquence dans la 3'UTR Cet élément maintient une queue poly(A) longue sur l'ARNm -globine Une forme de thalassémie est liée à l'inactivation de cet élément

26 Exemple 2 Les ARNm des cytokines ou proto-oncogènes sont souvent très instables Cette instabilité leur est conférée par un élément de désadénylation dans la 3'UTR L'inactivation de cet élément conduit à la surexpression de la protéine codée Cette surexpression peut être associée à une transformation cellulaire Contrôles aberrants de létat dadénylation des ARNm et pathologies humaines

27 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 miRNA RNAi Prix Nobel oct 2006 (C Mello, A Fire) siRNA Et alors?

28 3. Contrôles post-transcriptionnels par les ARN non codants Une histoire récente… Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Mécanismes biochimiques

29 Biosynthèse des miRNA Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Reconnaissance dun ARN double brin par Argonaute!

30 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 1. Hybridation imparfaite sur les 22 nt : Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Conséquence : inhibition de la traduction de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez lanimal

31 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Zamore et Halley 2005 Science 309, 1519 Conséquence : dégradation de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante

32 Fonction des miRNA LARN simple brin (22nt) shybride à un ARNm cible (« target »), et entraîne Argonaute sur cet ARN 2. Hybridation sur la totalité des 22 nt : Conséquence : dégradation de lARNm cible Voie miRNA « classique » chez la plante… … Mais si lon apporte un ARN double brin parfaitement complémentaire dun ARNm cible chez lanimal, cela provoque sa dégradation… voie « siRNA » chez lanimal

33 Reprenons… miRNA : ARN double brin (2*22nt) codé par le génome de la cellule (sous forme dun précurseur qui est maturé) Environ 250 chez lhumain Sapparie imparfaitement à un ARN cible et inhibe sa traduction (animal), ou sapparie parfaitement et provoque sa dégradation (plante) (Il y a des exceptions…) En général, un miRNA sapparie aux 3UTR dun ou plusieurs ARNm siRNA : ARN double brin (2*22nt) apporté par lexpérimentateur dans une cellule animale Sapparie parfaitement à un ARNm cible et provoque sa dégradation

34 Utilisation des siRNA Lexpression dun ARN double brin (2*22nt) dans une cellule animale provoque la dégradation des ARNm dont la séquence est parfaitement identique à celle de lun des deux brins Applications en recherche… … Et en médecine?

35 Régulations post-transcriptionnelles par les miRNA et développement Lexemple de Caenorhabditis elegans

36 La vulve de Caenorhabditis elegans * proximité de la vulve.

37 Formation de la vulve * proximité de la vulve. P6.p se divise en cellules qui se différencieront en cellules centrales de la vulve P5.p et P7.p se divisent en cellules qui se différencieront en cellules latérales de la vulve Rôle de AC (induction)

38 Les inductions dans la formation de la vulve Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330 Première induction (voie EGF) Deuxième induction (voie Notch) « Marqueurs » de destinée cellulaire

39 La GFP marque les cellules P5.p et P7.p, mais pas P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330 Contrôle Le miRNA mir-61 est présent dans P5.p et P7.p, mais pas P6.p

40 … Sauf si on exprime le miRNA mir-61 dans P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330 Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p

41 … Sauf si on fait sexprimer le miRNA mir-61 dans P6.p Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330 Contrôle Expression de mir-61 dans P6.p mir-61 exprimé dans P6.p « fait devenir » P6.p comme P5.p et P7.p

42 Recherche dun ARNm cible de mir-61 Fonction de la protéine codée par cet ARNm : faire « devenir une cellule comme P6.p » Dans lembryon normal : mir-61 est présent dans P5.p et P7.p Il empêche lexpression de cet ARN dans P5.p et P7.p P5.p et P7.p deviennent « comme P5.p et P7.p » Si on exprime mir-61 dans P6.p Il empêche lexpression de cet ARNm dans P6.p aussi P6.p devient « comme P5.p et P7.p » ARNm codant la protéine vav-1 Yoo et Greenwald 2005 Science 310, 1330

43 Doù la fonction dun miRNA dans la mise en place de la vulve… … Implication dans dautres processus de développement chez C. elegans

44 Le cycle de C. elegans

45 Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653 Les mutants hétérochrones chez C. elegans

46 Alvarez-Garcia et Mlska 2005 Development 132, 4653 Rôle de miRNA dans la coordination dévènements de développement chez C. elegans

47 miRNA et pathologies humaines (1) Mutation dans la 3UTR de SLITRK1, au niveau du site de reconnaissance de miR-189 Perte de la répression traductionnelle de SLITRK1 : surexpression de la protéine SLITRK1 Responsable de la maladie?

48 miRNA et pathologies humaines (2)

49 miRNA et pathologies humaines (3)


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