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Métabolisme des carbohydrates Chez la levure Exemple du Galactose.

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1 Métabolisme des carbohydrates Chez la levure Exemple du Galactose

2 Mécanisme impliqué dans lexpression coordonnée des gènes Gal Johnston, M. A model fungal gene regulatory mechanism: the GAL genes of Saccharomyces cerevisiae. Microbiol Rev 51, (1987).

3 Etude des régulations transcriptionnelles Génétique : identification des facteurs protéiques - Gels retards, Empreintes à la Dnase etc. : identification des séquences de liaison. - Expression dun gène rapporteur sous le contrôle des séquences promotrices. - Mutagenèse dirigée. Modèle : le contrôle de la transcription se réduit à des interactions entre - facteurs de transcription (protéines diffusibles) et séquences promotrices (ADN). - Facteurs de transcription et corégulateurs (Protéines).

4 La chromatine, substrat de la machinerie transcriptionnelle

5 Le nucléosome : unité élémentaire de la chromatine ADN : 1,67 tours ; 147 paires de bases

6 Structure du nucléosome : - très compacte (forte densité électronique) - Environ 150 liaisons Hydrogène entre les histones et lADN - Forte distorsion de la double hélice Les conditions expérimentales sont très éloignées du contexte physicochimique de la chromatine.

7 Dans le noyau, la fibre chromatinienne sorganise pour former des structures encore plus compactes

8 Régulation de la transcription dans le contexte de la chromatine - Recrutement des facteurs de transcription - Recrutement et mobilité de lARN polymérase Remodelage de la chromatine - ATP-Dépendant - ATP-Indépendant

9 ATP-Dependant Transitoire Local (promoteurs) Non diffusible Non transmissible ATP-Independant Stable Diffusible à léchelle dun locus Transmissible (épigénétique) Mécanismes de remodelage de la chromatine

10 - Déplacement des nucléosomes - Complexes de remodelage (SWI/SNF, ISWI etc.) - Remplacement des histones canoniques par des variants dhistones - Chaperons moléculaires Mécanismes de remodelage de la chromatine - Modifications post- traductionnelles des histones - Enzymes de modification

11 HAT: Histone Acétyl Transférases HDAC: Histones DésACétylases HMT: Histones Méthylases Histone Déméthylase: (LSD1 : Lysine-specific demethylase) Enzymes de modification des histones

12 Modifications post-traductionnelles des histones Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, (2002).

13 Modifications post-traductionnelles des histones Turner, B. M. Cellular memory and the histone code. Cell 111, (2002).

14 La chromatine est une structure hétérogène: Euchromatine: Gènes actifs Peu condensée (configuration ouverte) ADN peu ou pas méthylé (CpG) Hétérochromatine constitutive: Régions intergéniques, ADN répétitif, centromères Condensée (configuration fermée) ADN méthylé (CpG) Hétérochromatine facultative: Gènes réprimés Condensée (configuration fermée) ADN méthylé (CpG)

15 Euchromatine Hétérochromatine Les différents états de la chromatine sont caractérisés par des marques épigénétiques spécifiques : « Code Histones »

16 Interpréter le « Code Histones » : Les marques épigénétiques permettent le recrutement de protéines effectrices qui modulent la structure de la chromatine. Margueron, R., Trojer, P. & Reinberg, D. The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev 15, (2005).

17 Etats de la chromatine à léchelle dun locus Exemple : Les gènes de lidentité sexuelle Chez la levure

18 Vengrova, S. & Dalgaard, J. Z. RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching. Genes Dev 18, (2004). Région Mat (mating type) chez Schizosaccharomyces pombe

19 Analyse moléculaire de la chromatine par immuno- précipitation (ChIP)

20

21 HP1 Les gènes Mat réprimés sont enrichis en HP1, une protéine spécifique de lhétérochromatine Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, (2001).

22 Les gènes Mat réprimés sont enrichis en H3K9 méthylée, une modification spécifique de lhétérochromatine

23 Les gènes Mat réprimés sont appauvris en H3K4 méthylée, une modification spécifique de leuchromatine

24 Grewal, S. I. & Elgin, S. C. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev 12, (2002).

25 Comment ça marche ? Noma, K., Allis, C. D. & Grewal, S. I. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science 293, (2001). H3K9-Me (Clr4) Recrutement De Swi6 H3K4-Me + _ _ ?

26 Méthylation de H3K9 Indépendante de HP1/SWI6 Méthylation de H3K9 Dépendante de HP1/SWI6 Rôle de CenH et de HP1/SWI6 cenH est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de Swi6 Swi6 est nécessaire à la méthylation de H3K9 en absence de CenH Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science, 297(5590),

27 H3K9-Me (Clr4) Recrutement De Swi6 CenH H3K9-Me (Clr4) Hypothèse: Etablissement de lhétérochromatine à partir de CenH Maintien et propagation dépendante de Swi6

28 Rôle de HP1/SWI6 dans la propagation de lhétérochromatine

29 CenH, une séquence répétée homologue des séquences centromériques, agit comme un point de nucléation de lhétérochromatine. HP1/Swi6 est ensuite nécessaire à la propagation de lhétérochromatine en cis

30 Mécanismes de propagation de lhétérochromatine

31 Ura4-OnUra4-OffStable Transmission épigénétique Variegation en absence de cenH

32 Transmission épigénétique des états Ura4-on et Ura4-ff Spores His2+/Ura4-on Spores His2-/Ura4_off Transmission des marques épigénétiques Spécifiques des souches Ura4-On et Ura4-Off

33 Dans les souches Ura4-On, l'hétérochromatine est rétablie en présence d'un excès de Swi6 mais pas de Clr4 Ura4-on Ura4-off H3K9-Me (Clr4) Recrutement De Swi6 CenH H3K9-Me (Clr4) H3K9-Me (Clr4) Excès De Swi6 CenH H3K9-Me (Clr4) X X X X X

34 La machinerie d'ARN-interférence (RNAi) est nécessaire à la répression transcriptionnelle et à l'établissement de l'hétérochromatine Ago1 = Argonaute Dcr1 = Dicer Rdp1 = RNA-dep RNA-Pol Construction Ectopique Ade6 exprimé Ade6 réprimé

35 TSA = Trichostatin Inhibiteur des HDACs La machinerie RNAi n'est pas nécessaire au maintien de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine La machinerie RNAi est nécessaire à l'établissement de la répression transcriptionnelle et de l'hétérochromatine

36 Comment stopper lhétérochromatine ?

37 Passées les bornes, y a plus de limite : Les Eléments Frontières ou Insulateurs

38 Des mécanismes similaires ont été mis en évidence chez la Drosophile…

39 Répression du gène White : - Associée à une propagation en cis de lhétérochromatine, visible sur les chromosomes polythènes. - Stochastique (Concentration limitante dun facteur de propagation ?) - Clonale (transmission à travers les mitoses). Bigarrure à effet de position (PEV) Grewal02

40 Chez la Drosophile aussi, létablissement de lhétérochromatine dépend de la machinerie RNAi

41 … Et chez les mammifères

42 Maturation des Thymocytes Thymocytes immatures Thymocytes matures Expression des gènes Rag1, Rag2, Dntt impliqués dans la recombinaison VDJ du récepteur TCR Répression des gènes Rag1, Rag2, Dntt

43 Modifications post-traductionnelles de la chromatine sur le gène Dntt (ChIP) Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation. Nat Genet, 36(5), Epub 2004 Apr 18.

44 Propagation de lhétérochrompatine sur le gène Dntt Euchromatine Hétérochromatine

45 La répression du locus Dntt est corrélée à son association avec lhétérochromatine péricentromérique

46 Propagation de lhétérochromatine En trans ?

47 Ikaros Liaison à lADN (ZF) Cofacteur transcriptionnel spécifique de la lignée hématopoiétique Activateur ou Répresseur Répresseur des gènes Rag1/2 et Dntt pendant la maturation des thymocytes Existe sous forme de complexe avec NuRD (nucleosome remodelling and deacetylation)

48 Ikaros -Satellites Ikaros HP1 Localisation dIkaros dans lhétérochromatine péricentromérique Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin. Cell, 91(6),

49 Lymphocytes B Immatures Matures CD19 CD8 5 CD Corrélation inverse entre lexpression des gènes et leur localisation à proximité des foyers Ikaros Ikaros FISH

50 (NuRD) Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). Assembly of silent chromatin during thymocyte development. Semin Immunol, 17(2),

51 Comment échapper à la répression ? Le rôle des Enhancers

52 Promoteur -globine + Enhancer -globine Enhancer du gène -Globine (lignée érythroïde) Francastel, C., Walters, M. C., Groudine, M., and Martin, D. I. (1999). A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin. Cell, 99(3),

53 T0 = Arrêt de la sélection néomycine (G418) --> FACS 5HS2: Enhancer -Globin Pr: Promoteur -Globin Geo: Fusion -Gal – Néo Stratégie utilisée

54 En absence denhancer fonctionnel, le transgène est fortement réprimé lorsquil est intégré aux sites 6.2 et C30 La présence dun enhancer fonctionnel retarde la répression du transgène

55 Site 6.2 Lorsque le transgène est actif, la chromatine est en configuration ouverte, même en absence denhancer fonctionnel Sensibilité à la Dnase I FACS _ +

56 Position du transgène par rapport aux centromères En Cis

57 Transgène Centromères DAPI Position du transgène par rapport lhétérochromatine péricentromérique En Trans FACS _ +

58 Transgène Centromères DAPI Enhancer fonctionnel: le transgène séloigne du centromère, uniquement lorsquil est exprimé. Enhancer inactif: le transgène est au voisinage du centromère, même lorsquil est exprimé FACS _ +

59 PCH E E E Répression stable DNAse HS- Expression transitoire DNAse HS + Expression transitoire DNAse HS + Expression transitoire DNAse HS + Répression transitoire DNAse HS-

60 ? PCH E E E Expression transitoire DNAse HS + Répression transitoire DNAse HS- Où vont les gènes lorsquils séloignent de lhétérochromatine péricentromérique ?

61 La LCR (Locus Control Region) est nécessaire au recrutement du gène -Globine dans les usines de transcription. Cellules érythroïdes matures de foie foetal Souris WT Souris -LCR par recombinaison homologue WT -LCR Ragoczy, T., Bender, M. A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). The locus control region is required for association of the murine beta- globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation. Genes Dev., 20(11), Epub 2006 May 16.

62 Recrutement des gènes transcrits dans les usines de transcription.

63 Organisation et expression allélique des gènes du chromosome 7 dans les cellules érythroïdes de la Rate Cellules érythroides de Souris Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., and Fraser, P. (2004). Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat Genet, 36(10), Epub 2004 Sep 7.

64 Expression allélique Localisation dans les foyers RNAP-II Hbb-b1 RNAP-II RNA FISH DNA FISH Recrutement des gènes actifs dans les foyers de RNAP-II

65 Hbb-b1 Eraf RNAP II Des gènes distants peuvent être recrutés dans les mêmes foyers de RNAP-II

66 Confirmation Biochimique : Chromosome Conformation Capture (3C)

67 Hbb-b1

68 dezaded Hypothèse : le co-recrutement des gènes dépend de la distance qui les sépare

69 Délocalisation des gènes Hox

70 Cellules ES + RA Expression des gènes du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes Dev, 18(10),

71 Etat de la chromatine sur le locus HoxB (ChIP) pendant la différenciation des cellules ES Hoxb1 Hoxb9 Lacétylation de H3K9 ne permet pas dexpliquer lactivation séquentielle de Hoxb1 et Hoxb9

72 Hoxb1 Hoxb9 DAPI Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

73 Hoxb1 Hoxb9 DAPI Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

74 - RA + RA Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

75 - RA + RA Délocalisation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

76 RA Décondensation du locus Hoxb pendant la différenciation des cellules ES

77 Lexpression séquentielle des gènes Hox est corrélée à leur délocalisation hors du territoire chromosomique

78 Des observations similaires ont été faites dans les embryons de souris Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., and Bickmore, W. A. (2005). Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development., 132(9),

79 + Rapamycin - Rapamycin Voir bouger la chromatine Chuang, C. H., Carpenter, A. E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont, A. S. (2006). Long-range directional movement of an interphase chromosome site. Curr Biol., 16(8),

80 Le noyau est organisé en domaines fonctionnels : Domaines activateurs : Euchromatine, usines transcriptionnelles - usines dépissage Domaines répresseurs : Hétérochromatine Les gènes sont recrutés de manière coordonnée dans ces domaines. Le recrutement des gènes dans ces domaines est couplé à des modifications post-traductionnelles des histones. Ces modifications contribuent à la stabilité et à lhéritabilité (transmission épigénétique) de leur état (activé ou réprimé). Etat de lart

81 Rôle des modifications post- traductionnelles des Histones Rendre les gènes plus accessibles aux facteurs de transcription?

82 Le facteur de transcription UBF1 (genes ribosomiques; RNA-Pol I) est rapidement remplacé sur les chromosomes mitotiques GFP-UBF1 Pas si simple… Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang, S. (2005). Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins. J Cell Biol, 168(1), Epub 2004 Dec 28.

83 Les modifications post- traductionnelles des histones sont- elles nécessaires à lorganisation nucléaire de la chromatine? Séquentialité des événements ? Relations de causalité ?

84

85 Bibliographie Brown, K. E., Guest, S. S., Smale, S. T., Hahm, K., Merkenschlager, M., and Fisher, A. G. (1997). Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin. Cell, 91(6), Chambeyron, S., and Bickmore, W. A. (2004). Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. Genes Dev, 18(10), Chambeyron, S., Da Silva, N. R., Lawson, K. A., and Bickmore, W. A. (2005). Nuclear re-organisation of the Hoxb complex during mouse embryonic development. Development., 132(9), Chen, D., Dundr, M., Wang, C., Leung, A., Lamond, A., Misteli, T., and Huang, S. (2005). Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins. J Cell Biol, 168(1), Epub 2004 Dec 28. Chuang, C. H., Carpenter, A. E., Fuchsova, B., Johnson, T., de Lanerolle, P., and Belmont, A. S. (2006). Long-range directional movement of an interphase chromosome site. Curr Biol., 16(8), Francastel, C., Walters, M. C., Groudine, M., and Martin, D. I. (1999). A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin. Cell, 99(3), Grewal, S. I., and Elgin, S. C. (2002). Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure. Curr Opin Genet Dev, 12(2), Hall, I. M., Shankaranarayana, G. D., Noma, K., Ayoub, N., Cohen, A., and Grewal, S. I. (2002). Establishment and maintenance of a heterochromatin domain. Science, 297(5590), Margueron, R., Trojer, P., and Reinberg, D. (2005). The key to development: interpreting the histone code? Curr Opin Genet Dev, 15(2), Noma, K., Allis, C. D., and Grewal, S. I. (2001). Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science, 293(5532), Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., and Fraser, P. (2004). Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat Genet, 36(10), Epub 2004 Sep 7. Ragoczy, T., Bender, M. A., Telling, A., Byron, R., and Groudine, M. (2006). The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation. Genes Dev., 20(11), Epub 2006 May 16. Su, R. C., Brown, K. E., Saaber, S., Fisher, A. G., Merkenschlager, M., and Smale, S. T. (2004). Dynamic assembly of silent chromatin during thymocyte maturation. Nat Genet, 36(5), Epub 2004 Apr 18. Su, R. C., Sridharan, R., and Smale, S. T. (2005). Assembly of silent chromatin during thymocyte development. Semin Immunol, 17(2), Turner, B. M. (2002). Cellular memory and the histone code. Cell, 111(3),


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