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Production de protéines recombinantes chez les plantes « Molecular farming »

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Présentation au sujet: "Production de protéines recombinantes chez les plantes « Molecular farming »"— Transcription de la présentation:

1 Production de protéines recombinantes chez les plantes « Molecular farming »

2 Définition « Molecular farming » : Production de protéines dintérêt pharmaceutique par des organismes recombinants Franken et al. (1997) Curr Opin Biotech. Ne rentre pas dans cette définition : La production danticorps anti-pathogènes de plante chez le blé

3 Les protéines thérapeutiques, un marché en pleine expansion Prévision 2010 : 60 milliards de $ Pissara (2004) Nature Biotech.

4 Production de protéines recombinantes Le plus simple : Production dinsuline par une bactérie Le plus complexe: Production de complexes à plusieurs sous-unités (IgA) par une plante de grande culture

5 Actuellement : virage technologique Abaissement drastique des coûts de production en systèmes hétérologues Bouleversement important à venir dans les pratiques médicales

6 Avant tout : quelle protéine exprimer ? Démarche Caractérisation dune protéine dintérêt pharmaceutique Clonage, mise au point de la production Exemple 1921 : linsuline facteur anti-diabète 1951 : séquençage peptidique 1982 : expression en bactérie 1997 : première autorisation de mise sur le marché Fisher et Emans (2000) Transgenic Res.

7 Mais…. Linsuline est une protéine simple : Faible poids moléculaire non glycosylée Lexpression en bactérie fonctionne exceptionnellement bien

8 Production de protéines complexes Organismes eucaryotes Levures Cellules animales : lait, urine Cellules dinsecte : système baculovirus

9 Le végétal comme système dexpression Milieux de culture simples et peu coûteux / cultures animales De leau, du substrat et du soleil Possibilité de monter en échelle la production Filière des plantes protéagineuses Applications médicales très « gourmandes » en quantité de protéines Stabilité des protéines dans les organes de stockage

10 Le végétal comme système dexpression Maturation des protéines similaire aux mammifères Pas de pathogènes pour lhomme Pas dendotoxines

11 Premiers succès de production chez les plantes Hormone de croissance humaine Interférons (antiviraux - anticancéreux) Sérum albumine humaine

12 1989 : production danticorps par des plantes Production de sous-unités lourdes () et légères () dune IgG dans des lignées différentes de tabac Assemblage par croisement des lignées Obtention danticorps réactifs (contre la BSA) par test ELISA Hiatt et al. (1989) Nature

13 Le « boom » technologique Depuis 1990, dans des systèmes végétaux Anticorps Vaccins Facteurs sanguins Facteurs de croissance hématopoïétiques Effecteurs biologiques : interleukines Etc… 198 autorisations dessais au champ entre 1991 et 2002 aux USA Production compatible avec des tests pré- cliniques

14 Production de vaccins Production de peptides antigéniques

15 Exemples dapplications Hépatite B Choléra Diarrhées causées par E. coli

16 Vaccination orale de souris (Mus musculus) contre lhépatite B Production dantigènes de surface de lHBV dans des tubercules de pomme de terre Consommation de tubercules crus

17 Injection unique de vaccin commercial Semaines Anti-HBs (miU / ml) Richter et al Nature Biotechnology

18 Problèmes liés à la vaccination orale Pomme de terre > 100 g de tubercule cru !! Banane Palatabilité supérieure Reste le problème de la quantité Améliorations Niveaux dexpression Adjuvants

19 Production dimmunoglobulines

20 Immunoglobulines Diagnostique Anti-IgG Thérapeutique Caries dentaires (CaroRx ®, PlanetBiotechnology) Ciblage de cellules cancéreuses pour la radiothérapie (Monsanto)

21 Autres biomédicaments

22 Exemples de biomédicaments Lipase recombinante dans lendosperme de maïs (=Meripase ® produite par Meristem Therapeutics à Clermont Ferrand) Lactoferrine dans le riz (Ventria Bioscience)

23 Protéines pharmaceutiques pour animaux Stimulateurs du système immunitaire pour les crevettes Immunosphère TM Feed Additive Prodigene : anti-diarrhéique produit dans le maïs utilisé chez le porc

24 Purification des peptides Technologie corps lipidique / oléosine Exsudation racinaire des protéines

25 Technologie corps lipidiques / oléosine SemBioSys Genetic inc. Oléosines : Protéines organisatrices des gouttelettes lipidiques Fusion de protéine :: oléosine

26 Gene oléosineFusion oleosin + gène X Adressage Traduction om/equicom/sembiosys/ Main.aspx?id=24

27 Purification des protéines Corps lipidiques Extraits cytoplasmiques HomogénéisationSéparation Graines broyées Protéases Homogénéisation de la phase lipidique avec du tampon dextraction Corps lipidiques Protéines recombinantes

28 Une oléagineuse alternative pour la production de protéines Carthamus tinctorius Problèmes de propriété pour les plantes de grande culture Pas de mauvaise herbe apparentée dans lhémisphère nord

29 Exsudats racinaires Purification des protéines : Jusquà 90% du coût de production Système dexsudation racinaire Exsudation de substances carbonées (dont protéines) Rhizosphère : racine + microflore

30 Exsudats racinaires xylanase bactérienne Motif dadressage RE sécrétion dans le milieu extracellulaire Digestion dun substrat (RBB xylane) Témoin 35S:xylanase Borisjuk 1999 Nature Biotechnology

31 Le problème de la glycosylation

32 Les plantes ont le même « cœur » que les mammifères Chez les bactéries : pas de glycosylation Chez les levures : Polymannose glycanes Chez les mammifères et végétaux Le « cœur» est formé de deux résidus N-acetylglucosamine

33 N-glycosylation des protéines

34 Gomord et al Trends in Biotechnology

35 Dans certains cas, protéines recombinantes non-fonctionnelles Résidus potentiellement immunogéniques Allergie aux pollens : IgE spécifiques des N-glycanes de plantes Des différences qui posent problème… Les planticorps sont plutôt déconseillés pour une administration parentérale Usage ectopique ou oral

36 Impact sur le choix du système dexpression Profils de glycosylation différents Dune espèce à lautre Age des tissus Choisir une espèce / tissu / stade physiologique le plus favorable Le plus de % mannose possible

37

38 Gomord et al Trends in Biotechnology Enrichissement en résidus riches en mannose

39 Humanisation des protéines recombinantes Chez les végétaux : pas de β1,4- galactosyl-transférase Peut on modifier le système de glycosylation des plantes ?

40 Coexpression dune GalT AnticorpsGalactosyl transférase Anticorps + GalT

41 Anticorps Anticorps + GalT Bakker et al. (2001) PNAS GlcNacß1-2Man1- 3/6 Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-6 Galß1-4GlcNAcß1-2Man1-3 Fuc 1-3 Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAc Problème résiduel

42 Cependant… Les humains sont exposés constamment aux glycoprotéines de plantes Même des protéines complètement humanisées peuvent se révéler immunogènes Pas de prédictibilité pour le caractère allergénique des protéines recombinantes

43 Gomord et al Trends in Plant Science Le suivi post-marketing des patients est un impératif dans le domaine des biomédicaments

44 Culture en plein champ

45 Cultures en plein champ Avantages Faible investissement en technologie agricole Fort potentiel de changement déchelle de production (« scalability ») Inconvénients Mise au point des itinéraires techniques Variabilité climatique Difficulté dappliquer des normes de bonnes pratiques de fabrication courante (BPFc) Problèmes de dissémination

46 Quelques scandales ayant marqué les esprits Affaire Prodigene : En 2003, une contamination dans le Nebraska dune récolte de soja par des rejets de maïs produisant une protéine thérapeutique utilisée contre la diarrhée chez le porc provoque une révision des conditions de sécurité appliquées aux USA. La même année des maïs conventionnels avaient été contaminés dans lIowa par du maïs prodigene Greenpeace sempare du sujet Amende $ Affaire Starlink : Maïs contenant un insecticide Cry9C interdit pour la consommation humaine mais autorisé pour la consommation animale. Pendant lannée 2000, on en retrouve dans plus de 300 produits amende historique

47 Stratégies de confinement Exemple de Meristem Therapeutics Isolement géographique Isolement temporel Stérilité mâle Matériel de récolte dédié Exemple de Biolex Therapeutics Lentille deau (Lemna minor) Production confinée Pas de pollen, pas de consommation Productivité très importante

48 Conclusion Expression hétérologue dans un système végétal : Nombreuses applications au stade pré- industriel Un système dexpression qui peut savérer tout à fait concurrentiel dans certains cas Très gros potentiel de développement


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