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Ecole Doctorale de Cancérologie Master 2 de Physique Médicale PARIS XI (2006-2007) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables:

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1 Ecole Doctorale de Cancérologie Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de lADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire dOrsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

2 Matière vivante Conséquences Biologiques Environnementales Sanitaires Radiobiologie Rayonnements IonisantsUltraviolets Approches expérimentales et conceptuelles Physique (rayonnements, dosimétrie); Chimie (chimie radicalaire); Biologie: (moléculaire, cellulaire, enzymologie, génotoxicologie, génétique, cancérologie) Médecine (radiothérapie, radiopathologie, radioprotection)

3 La radiobiologie vise à mieux comprendre l interaction de l irradiation avec la matière vivante et les conséquences biologiques à court et long termes (létalité, altérations génétiques, cancer...) Une meilleure connaissance dans ce domaine permet la radiosensibilité - une définition de la radiosensibilité des cellules normales et tumorales, des tissus et des individus. radioprotection -une meilleure radioprotection -une meilleure adaptation des doses de radiodiagnostic et de radiothérapie Radiobiologie

4 Expositions aux radiations Régions dune radioactivité naturelle élevée50 à 100 mSv/an (Kerala (Indes), Brésil) Radioactivité naturelle (France)2,4 mSv/an Montagne à 1500 m d altitude3,6 mSv/an Scanner6 mSv /an Domaine médicale1 mSv/an Vol Concorde Paris/New York0,06 mSv per trajet Centrales nucléaires en France0,002mSv/an Pollution par les essais aériens des années 600,005mSv/an (2001) Pollution après Tchernobyl en Europe de l ouest0,002 mSv/an(2001)

5 Une meilleure compréhension des mécanismes à la base des effets des radiations ionisantes peut aider à: 1. Trouver des agents chimiques qui modifient la réponse -- radioprotection des cellules normales -- radiosensibilisation des cellules tumorales 2. Définir la radiosensibilité intrinsèque des tumeurs -- pronostic -- protocole thérapeutique « individualisé » 3. Définir la radiosensibilité des individus -- exposition environnementale et protection -- détection d hétérozygotes pour des gènes de radiosensibilité (ataxie telangiectasie..)

6 Identification de l ADN comme cible importante de l irradiation ionisante - 60 désintégrations d I 125 par noyau donnent 50% de survivants (iododéoxyuridine: analogue de base incorporé dans l ADN des chromosomes ) désintégrations d I 125 à la surface membranaire donnent 50% de survivants (concanavaline A iodinée) On a déduit que l ADN est la cible la plus importante des désintégrations radioactives

7 Le corps humain est constitué de milliards de cellules (en grande partie régulièrement renouvelées) Tissus cellulaires Cellule: unité de fonctions Noyau avec le matériel génétique (ADN) Noyau avec le matériel génétique (ADN) mitochondrie ADN en double hélice

8 LADN est le vecteur de linformation génétique: La séquence des nucléotides dans lADN ordonne (ou code) la séquence des acides aminés dans les protéines - LADN sert de matrice pour sa propre réplication - Toutes les molécules dARN sont produites sur les matrices ADN - Toutes les séquences protéiques sont déterminées par les matrices dARN duplication transcription traduction ADN ARN Protéine

9 sucre phosphate TA G C GC TA C T G A bases pyrimidiquesbases puriniques 5 3 ponts phosphodiester désoxyribose (sucre) Structure de lADN, vecteur de lhérédité Les unités fonctionnelles de lADN, les gènes, sont définies par les séquences des bases (T-A-G-C) sur les deux brins complémentaires. 2 nm Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

10 Appariement de bases dans l ADN

11

12 ADN chromosome

13 Rayons cosmiques Rayons Gamma Rayons X Radiations UV Lumière Visible Radiations Infrarouge Ondes Radio Radiations solaires UVCUVBUVA longueurs donde (en nanomètres) Radiations absorbées par lozone Radiations ultraviolettes terrestres (D après SAGE, CNRS / Curie 1997) Spectre des ondes électromagnétiques Radiations ionisantes

14 Carcinogenèse: processus multi-étape InitiationPromotionProgressionCancer TumeurMétastases Agents génotoxiques, UV, RI, virus etc. Dommages de lADN Mutations Réparation de lADN Instabilité génétique Sélection clonale Cellules malignes Induction de gènes Transduction des signaux

15 Dommages endogènes de lADN (selon E. Mullaart et al. Mutat. Res. 237, (1991)) SourceType de dommage Taux de lésions induites endogènepar cellule et par jour Température (37°)Cassures simple brin Sites AP10000 Démination de la cytosine Radicaux libresDommages de bases (total)10000 MetabolismeDommages des sucres/bases Pontages ADN-protéine ? Pontages ADN/ADN ? Cassures simple et double brin ?

16 Dommages exogènes induits par des agents génotoxiques

17 Endogenous and exogenous DNA damage (adapted from E. Mullaart et al. Mutat. Res. 237, (1991)) SourceType of DNA damage Estimated number of lesions Endogenousinduced per cell and per day body temperaturesingle strand breaks AP sites Deamination Free radicalsBase damage MetabolismSugar, base damage, DNA- protein CL Exogenous Sun-bathing (1h)Thymine dimers Smoking (20 cigarettes/day)DNA adducts of PAH Coal power stationBPDE Natural radiation single strand breaks2 per year background ( mSv/year) D. Averbeck, Inst. Curie, UMR2027 CNRS, Orsay

18 Lésions endogènes dans lADN Desamination de la cytosineOxydation de la guanine

19 Dommage de base Cassure simple brin Cassure double brin et lésions complexes Réponse aux agents génotoxiques (radiations etc.) Signalisation Induction de gènes Arrêt du cycle cellulaire Réparation Mort cellulaire correcteincorrecte Survie Instabilité génétique Carcinogenèse Transformation cellulaire Mutation

20 Dommages radio-induits dans lADN Cassure simple brin (CSB) Pontage ADN-protéine Pontage intrabrin Modification dune base (oxydation, réarrangement, adduits) Cassure double brin (CDB) Site abasique (apyrimidique ou apurique) protéine ADN Lésions complexes et groupées, Dommages multiples localisés (LMDS)

21 Dommages oxydatifs de l ADN

22

23 Test de comètes Noyaux de lymphocytes avant et après irradiation Sans traitement + Fpg Irradiation : 8 Gy 8 Gy + Fpg Lymphocytes inclus dans 1% agarose lame de verre Lyse (Triton X M NaCl, pH10) Noyau Bases oxydées clivées par Fpg et Nth Séparation des brins dADN (300 mM NaOH, 10 mM Na 2 EDTA) -Electrophorèse (0,6 V/cm, 1h ) -Neutralisation, coloration avec DAPI -Analyse sous microscope de fluorescence Lymphocyte Les fragments de lADN forment la queue de la comète, dépendant du nombre de cassures et de dommages oxydatifs radioinduits.

24 Test de « comètes » Fragmentation du matériel génétique (ADN) dans les noyaux de cellules humaines après un stress génotoxique Cellules non endommagées Cellules traitées par des rayons

25 Niveau de dommages oxydatifs (8-oxoG) dans le sang humain (lymphocytes) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 FranceIreland Espagne Pays-Bas Angleterre Hommes Femmes (D aprèsA.R. Collins, BioEssays 1999; 21: )

26 Induction de dommages oxydatifs (cassures) dans l ADN de lymphocytes humains et protection Superoxyde d hydrogène (A.R. Collins, BioEssays 1999; 21: )

27 Les lésions radio-induites dans lADN Radiation ionisante O H H OH° e aq - Effets directs (30-40%) par excitation/ionisation Effets indirects (60-70%) par les radicaux libres de radiolyse de leau CDB/LMDS CSB Pontages ADN/protéine Bases modifiées (oxydées) Sites abasiques (AP) Pontages ADN/ADN Adduits (Chapman et al. Radiat. Res. 56, ,1973; Roots R., Okada S. J Biol Chem. 278, ,1975)

28 Dommages multiples localisés (LMDS) t Rayons X, Dommages oxydatifs Cassure simple brin Cassure double brin Goodhead DT, IJRB 1994; 65: 7-17 Ward JF, IJRB 1994: 66: Dépôt d énergie par les électrons en fin de parcours ADN Les dommages multiples localisés (LMDS) radioinduits sont définies comme deux ou plusieurs lésions formées dans lADN au niveau dun ou deux tours de la double hélice à la fin du parcours des électrons radioinduits

29 Détection de CDB et de LMDS radioinduits dans les cellules de mammifère Les CDB sont détectées par électrophorèse en champ pulsé (ECP) séparation de fragments dADN jusquà environ 8 Mégabases Les dommages complexes ou LMDS contiennent plusieurs dommages oxydatifs et CSB très proches sur les brins dADN opposés. On connaît des N-glycosylases comme Fpg, Nth ou Nfo capables dintroduire une coupure aux sites oxydatifs. Les LMDS peuvent ainsi être transformés en cassures double brin additionnelles détectables par ECP. Utilisant cette approche, plusieurs auteurs ont trouvé un nombre considérable de LMDS (3 à 4 fois plus que de CDB!) après irradiation à haut et même à faible TEL (Sutherland B et al.,PNAS 2000; 97(1): ). Après surexpression des N-glycosylases hNTH et hOGG1 dans les cellules de mammifère, les effets cytotoxiques de lirradiation ionisante augmentent, ce qui est en accord avec linduction de LMDS in vivo et leur transformabilité possible par les N-glycosylases en CDB létales (Yang et al.,DNA Repair.2006;5(1): ).

30 Les effets létaux radio-induits sur les lymphoblastes TK humains augmentent quand lactivité des ADN glycosylases est augmentée (Yang N et al. DNA Repair 5,2006;43-51) Apparemment, lincision des LMDS par les glycosylases augmente la létalité radioinduite. Par contre, linhibition de lactivité hOGG1 diminue la létalité.

31 La détection des LMDS dans les cellules humaines irradiées Contrairement aux données de la littérature, en utilisant une méthodologie limitant les oxydations artefactuelles lors de la lyse cellulaire, nous avons mis en évidence relativement peu de ce type de lésions dans les cellules de mammifère après irradiation à faible et haut TEL. ---> Les lésions groupées (LMDS) prédites consistent probablement majoritairement en CDB complexes avec des terminaisons oxydées; ces lésions complexes et hautement réfractaires à une réparation sont probablement plus létales que mutagènes. LMDS artefactuelles Véritables LMDS

32 Technique délectrophorèse en champ pulsé (ECP) Coloration Cellules Moule à blocs Lyse de membranes cellulaires Traitement enzymatique éventuel (Fpg / Nth) Inclusion des blocs dans un gel dagarose Cellules incluses dans lagarose Électrophorèse

33 Schéma d une analyse Irradiation des cellules (incubation post-radique à 37°C possible pour l étude de la réparation des dommages) Irradiation des blocs d agarose Inclusion des cellules dans des blocs d agarose Préparation des blocs d agarose Traitement des blocs d agarose (lyse des membranes cellulaires et éventuellement, traitement avec une glycosylase ou endonucléase) Électrophorèse Analyse d image et quantification Inclusion des blocs d agarose dans le gel d électrophorèse Coloration du gel (BET) Calculs de la FAR, la taille moyenne des fragments, la fréquence des CDB Dose (Gy) FAR (%)

34 Electrophorèse en champ pulsé Chr Gy HD FD Gy0

35 R 2 = 0, Dose (Gy) FAR (%) HD Cassures double brin sont radioinduites linéairement avec la dose (Résultats obtenus par électrophorèse en champ pulsé)

36 Visualisation des CDB radio-induites par les anticorps dune protéine de réparation (Rad51) (vert) et de lhistone -H2AX (rouge) indicateur de CDB (Aten JA Science Jan 2;303(5654):92-5) A: Rad51 B & C: Rad51 + -H2AX ; 30 min D & E : Rad51 + -H2AX ; 60 min

37 Induction de CDB radioinduites par la phosphorylation de lhistone H2AX (Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: )

38 Dommages endogènes et radio-induits de l ADN Dommages endogènes radio-induits /cellule/jour /Gy Cassures simple brin à Pertes de bases ? Dommages de bases Cassures double brin 8 40 Pontages ADN/ADN 8 30 Pontages ADN/protéine quelques-unes 150 Lésions multiples localisées (LMDS) quelques-unes? ? (selon Burkart W et al. CR Acad Sci III 1999; 322:89-101; Ward JF Prog Nucl Acdids Res Mol Biol. 1988; 35: )

39 Les lésions de lADN Ce sont des modifications accidentelles ou provoquées qui aboutissent à une anomalie de la constitution physique ou chimique de lADN 5 grandes classes de modifications: Modifications des 2-désoxyriboses de lADN (par arrachement datome dhydrogène par les radicaux *OH) ---> cassures simple et double brin (CSB, CDB), sites abasiques oxydés (2-désoxyribonolactone) (formation de pontages avec Endo III,Fpg,Neil1, Pol beta, voir Barker et al. 2005) Modifications des bases (environ 70) (seulement 8 détectées dans lADN cellulaire, voir Cadet et al.Free Radic Biol Med 33, , 2002) Pontages ADN - protéines (8-oxo dGuo/lysine de la protéine MutY, HickersonR.P. et al. 1999, Barker S. et al. 2005) Adduits exocycliques entre les bases de lADN et des aldéhydes ---> Pontages intra-et interbrins ? (P. Regulus et al. 2006, in press)

40 Radiolésions Nombre de lésions/10 9 bases/Gy Diols de thymine 97 FapyGuo 39 5-HmdURD 29 5-FordUrd 22 8-oxo-dGuo 20 FapydAdo 5 8-oxo-dAdo 3 5-OH-dUrd <0,2 Radiolésions formées dans lADN de monocytes humains (THP1) après irradiation selon Pouget et al. Radiat. Res,

41 (1)base endommagée(2) site abasique (3) cassure simple brin (CSB) sucre endommagé (4) site alcali-labile (5) pontage intra-brin dimère (TT,CT,CC) (6) pontage inter-brins pontages P-P ou Py-Py (7) bases endommagées sur les deux brins (8) bases endommagées et cassure simple brin en face (8) cassure double brin (CDB) et/ou dommages multiples localisés (LMDS) Lésions de lADN radioinduites

42 Photoréactions des rayons ultraviolets avec lADN RadiationChromophores Réaction Photoproduits UVC UVB UVA visible ADN Agents S photo- dynamiques 1 S - exogènes (psoralènes) Agents S photo- dynamiques 1 S - exogènes (psoralènes) Dimérisation - Py-Py dimères, - produits 6-4, - isomères Dewar Type I Type II Modifications de bases, CSB Oxydations de bases Pontages ADN-Protéines C 4 -adduits Pso<>Pyr 1O21O2 O2-O2- Fe 3+ OH° 3S3S S* H2O2H2O2

43 Photoproduits induits par les rayons UVB

44 Photolésions (nombre/ 10 9 bases) induites par UVB et UVA dans les cellules de hamster chinois CHO

45 Dommages oxydatifs induits par les rayonnements UVA et gamma dans les monocytes humains a) HPLC-ECD b) HPLC/GC-MS c) test de comètes

46 Radiation solaireRadiation ionisantePollution chimique Endommagement de lADN: Métabolisme oxydatif ----> cassures simple brin et lésions oxydatives Soleil ---> Dimères de pyrimidines, lésions oxydatives, cassures simple brin Radiation ionisante ----> dommages multiples sur tous les composants de lADN (cassures simple et double brin, dommages de bases, pontages intra-et interbrins, pontages ADN-protéine) Agents chimiques ---> formation d adduits et de pontages ADN-ADN et ADN-protéines Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

47 Interaction des radiations ionisantes avec lADN et conséquences biologiques Radiation ionisante Effets: - directs - indirects Réparation de lADN LétalitéSurvie Mutations Signalisation des dommages Dommages membranaires et cytoplasmiques Dommages de lADN Génome Génome intact Cancer Arrêt du cycle cellulaire

48 Contrôle de lintégrité de lADN Létat de l ADN est constamment contrôlé à la fois en vue: de la réplication du repérage des lésions Quand une lésion est repérée, des signaux sont émis afin de mobiliser les systèmes enzymatiques de réparation. Au moment où les ADN polymérases rencontrent la lésion, les stratégies réplicatives sont modifiées pour permettre la réparation et/ou le dépassement de cette lésion (par synthèse translésionnelle). Certaines systèmes de réparation fonctionnent de concert avec lactivité de lADN (ex.: lexcision de nucléotides couplé à la transcription) Fourche de réplication de l ADN Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

49 Voies de signalisation Dommage de l ADN Signalisation Arrêt du cycleRéparationApoptose

50 Irradiation ATM p53 Phase dinduction Phase dexécution Mitochondrie Caspases Clivages de PARP, DNA-PK cs, ICAD -----> Fragmentation de lADN SphingomyélineCéramideSphingosine Sphingosine- 1-phosphate ERK Survie cellulaire SAPK/JNK Sphingosine kinase PKC SMase

51 Bakkenist CJ et Kastan MB, Cell 2004;118:9-17 Signalisation par la protéine ATM

52 Détecteurs Transmetteurs Effecteurs Effets TT RIUV Bloc de réplication ATR/ ATM CHK1 CHK2p53 BRCA1 Nbs1Rad50 Mre11 Arrêt G2/MArrêt G1/S Apoptose Réparation / Arrêt du cycle P P P P P P Rad50 Nbs1 Mre11 XPC-HR23AB Rad1 Rad9 Hus1 Rad17 CDB CDB compl. TopBP1 Pol HR NHEJ Ku70/80 DNA-PKcs XPE

53 S. pombeS. cerevisiaeH. sapiens Cds1 =Chk2 Chk1 Rad53 =Chk2 Chk1 Dommages en G2Dommages intra-S Dommages en G2Dommages intra-S Chk2 Chk1 Rad3 Mec1 BRCA1 ? ATM M/R/N Senseurs Claspin? ATR ATRIP Chk2 Senseurs Arrêt du cycle Senseurs Mrc1Crb2 Senseurs Rad9 Mrc1 Cassures double-brin Autres types de dommages Dommages Senseurs Médiateurs Effecteurs Arrêt du cycle (Melo J, Toczyski D, Curr Opin Cell Biol (2): )

54 Dommage de l ADN Arrêt du cycle et réparation Dommages de l ADN réparés Cancérogénèse augmentée Endommagement de l ADN excessif Progression du cycle cellulaire Instabilité génomique Cellules normales APOPTOSE Sélection clonale des cellules résistantes à l apoptose Réponse aux radiations et aux stress oxydatifs

55 Ecole Doctorale de Cancérologie Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de lADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire dOrsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

56 1. Réversion in situ du dommage. 2. Excision de dommages a) Réparation des mésappariements b) Excision de bases modifiées Action spécifique de DNA-N-glycosylases sur un type de lésion (base altérée) Réparation des CSB (intervention de PARP1) 3. Excision de nucléotides modifiés 4. Réparation post-réplicative par recombinaison (homologue) réplication brècheincorporationréparation ou CSB PARP1 5. Réparation par recombinaison homologue (échange entre deux brins des deux ADN) 6. Réparation par religation non-homologue (après façonnage ligation avec perte du matérial. Ligation avec délétion) CDB Stratégies de la réparation

57 Réparation de lADN par réversion du dommage méthyl O 6 Gua G TT 3-OH dimère de pyrimidine élimination du méthyl par O 6 -méthyltransférase réversion par la photolyase ( chez les marsupiaux) réversion par lADN ligase I cassure simple brin ADN reconstitué GTT Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

58 Réparation des photolésions induites dans la peau par les rayons ultraviolets (UVB) (D après H. Stege et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000; 97: ) Témoin 2MED UV 1 min 5 min30 min

59 Réparation de dommages induits dans la peau par le soleil: application dune crème contenant des protéines (photolyases) capables deffectuer la réparation des photolésions dans lADN Crème après-soleilRéparation

60 Ligation des cassures simple brin avec 3-OH et 5-P termini par lADN-ligase OH P O O-O- O-O- O O O-O- P O O ADN-ligase, NAD ou ATP + AMP + nicotinamide mononucléotide ou Phosphodiphosphate

61 Reconstitution de lintégrité de la structure de lADN Reconnaissance de la base mal appariée Elimination de la base mal appariée Synthèse de réparation par laction dune polymérase Action de l ADN ligase IV Protéines: hMutS complexe (hMSH2/hMSH6) hMLH1/hPMS1 PCNA, RPA, RFC, FEN1 Réparation de bases mal appariées (60% des cancers héréditaires colorectaux non polyposiques sont liés aux mutationsde hMSH2, 35% des cancers du colon sont liés aux mutations dehMLH1)

62

63 ( Friedberg 2003)

64 Excision de bases Base endommagée AP endonucléase ADN glycosylases Synthèse par pol ou pol + PCNA+ FEN ADN ligase I ou ADN ligase III/XRCC1 ADN réparé 1. reconnaissance 2. excision 3. remplissage 4. reconstitution de lADN Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

65 Excision de bases

66 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 0h6h24h48h72h96h individu A individu B individu C Index de fragmentation de l ADN (UA) Temps Induction de cassures dans l ADN de lymphocytes humains révélée par le TEST des Comètes après une activité physique exagérée (tapis roulant) (d après A. Hartmann et al Mutagenesis 1994;9: )

67 Excision de nucléotides Réparation normale (avec XPC/ hHR23B) Reconnaissance et séparation des brins (TFIIH/ XPA/RPA/XPB/XPD) Incision et excision de la lésion avec ciseaux moléculaires (ERCC1/XPF + XPG) Remplissage par une synthèse réparatrice par Pol / Reconstitution de lintégrité de lADN par lADN ligase 1 TT Réparation durgence Réparation couplée à la transcription (TCR) (avec RNAPol II /CS-B) Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

68 XPC/hHR23B CS A, CS B, XPG(?) RNAPol II Réparation globale Réparation couplée à la transcription TFIIH XPA RPA TFIIH XPA RPA XPBXPD Reconnaissance de la lésion et séparation des brins dADN 53 ERCC1/XP-F XPG 35 Incision de deux côtés de la lésion Excision de loligonucléotide portant la lésion, synthèse et ligation Synthèse réparatrice Ligation par lADN ligase I Pol / PCNA XPA XPE incision 5 incision 3 Lésion NER

69 (en rouge: facteurs liés aux phénotypes de vieillissement ) Réparation par excision de nucléotide (NER): GG-NER et TCR-NER

70 Colocalisation de protéines dexcision de nucléotides après une irradiation UV à travers une grille (selon Gillet LCJ,Schärer OD. Chem.Rev.2006;106: ) (visualisation par des anticorps dimères ou XPA ou XPC spécifiques)

71 Variabilité individuelle des capacités de réparation de photolésions (dimères) chez 13 volontaires après exposition à 40mJ/cm 2 dirradiation solaire simulée ( selon G. Xu et al. Mutation Res. 2000;459: ) Photolésions résiduelles (%) Temps de réparation Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

72 Diminution de la capacité de réparation avec lâge Diminution de 0,62% par an de la capacité de réparation dans les lymphocytes humains in vitro (selon Q. Wei et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90: et S.I. Moriwaki et al. Mutat. Res. 1996; 364: ) Capacité de réparation diminuée dans certains cancers: - Carcinome basocellulaire (J. Alcalay et al. J. Invest. Dermatol. 1990; 95: ) - Cancer du poumon (D. Li et al. Cancer Res. 1996; 56: et Q. Wei et al. Cancer Res. 1996; 56: ). - Cancer du colon ( R. W. Pero et al. J. Natl. Cancer Inst. 1993; 70: ) - Cancer du sein (E. Kavas et al. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 1986; 22: ) Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

73 Réparation dune CDB par recombinaison homologue RI CDB Invasion et échange de brins Ligation par Ligase I Façonnage et recherche dhomologie hRad52 Recombinaison homologue entre les deux ADN Reconnaissance Reconstitution fidèle de lADN Ligation hRad51 Rad50/Mre11/Nbs1 complexe ADN homologue Dommage

74 Réparation des CDB par recombinaison homologue

75

76 (Schultz N. et al. Nucl Acids Res. 231(17)(2003), )

77 Induction et réparation de CDB radioinduites (Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: ) A: MRC-5 fibroblastes B: 180 BR fibroblastes: déficients dans la réparation (ligase IV)

78 Induction et réparation de CDB après des faibles doses de rayons X Absence de réparation à très faible dose (1,2 mGy) (Rothkamm et Löbrich, PNAS 2003;100: )

79

80 Cellules CHO-K1 R 2 = 0,9727 R 2 = 0, Dose (Gy) FAR (%) LDR HDR Mutant xrs-6 R 2 = 0,9922 R 2 = 0, Dose (Gy) FAR (%) LDR HDR Leffet du débit de dose sur linduction de CDB dans les cellules de mammifère implique une réparation par religation non homologue (NHEJ) Irradiation gamma: LDR: faible débit (0.05 Gy/min) HDR: haut débit (3.5 Gy/min)

81 En prenant l activation de H2AX (phosphorylation par ATM) comme indicateur des CDB radio-induites, les auteurs montrent qu à très faible débit de dose (94 mGy/h), les CDB ne sont pas réparées car elles ne sont pas reconnues par les protéines détectrices (MRE11-RAD50-NBS1) à cause d un défaut dans l activation d ATM. Absence de signalisation des CDB à très faible débit de dose Survie Ind. -H2AX Dose (Gy) ----> Comme dans le cas des faibles doses, un seuil de débit de dose semble exister pour la signalisation par ATM et pour la réparation. selon Collis et al. JBC 2004, Sept 14

82 Stratégies pour la réparation non fidèle des dommages ou leur tolérance 1. La religation non homologue des cassures double brin. (« non homologous end-joining= NHEJ ») Soudure des ruptures de lADN après façonnage et stabilisation par des protéines permettant à une ligase la religation. Ce processus nest pas fidèle mais est efficace pour assurer la survie cellulaire après irradiation. Par exemple, ce processus permet la réparation de cassures double brin radioinduites pendant une irradiation à faible débit de dose. 2. La synthèse de lADN translésionnelle. Grâce à des protéines ignorant plus ou moins la présence des lésions une synthèse d ADN peut avoir lieu. Dépendant de la performance des protéines impliquées dans la polymérisation de lADN (les polymérases ou ) la synthèse de lADN est assez fidèle (polymérase ou non fidèle (polymérase. Les patients atteints de la maladie Xeroderma pigmentosum variant prédisposant au cancer de la peau induit par le soleil sont porteurs dune protéine polymérase altérée. Il en résulte une hypermutabilité conduisant aux cancers multiples. lésion synthèse mutation Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

83 Réparation de CDB par religation non homologue (NHEJ) DSB Reconnaissance DNA-PK Ku70/80 Alignement DNA ligase IV /XRCC4 Ligation Radiation ionisante Recrutement et façonnage Reconstitution non fidèle de lADN Artemis Cernunos/XLF

84 Religation (suture) non homologue Non-homologous end-joining (NHEJ) (selon SJ. Collis et al. Oncogène 2004)

85 Réparation des CDB par religation non-homologue (NHEJ)

86 Wild-type scid Dose rayons X (Gy) Fraction de survivants Urushibara A et al. Biochem. Biophys.Res. Commun. 313(2004)

87 Rothkamm K. et al. 2004

88 Cellules CHO Temps dincubation (min) Lymphoblastes cellules temoins BRCA1 +/- BRCA2+/- p53+/- ATM-/- Cinétiques de réparation des CDB radioinduites

89 Urushibara A et al. Biochem. Biophys.Res. Commun. 313(2004)

90 Aberrations chromosomiques complexes après irradiation

91 Signalisation de la présence de dommages ----> par des protéines comme ATM, ATR. Reconnaissance des dommages ----> par les glycosylases (dommages oxydatifs), les protéines XPA, XPE (nucléotides), les protéines PARP, hRad52, Ku 70/80 et la DNA-PKcs (CSB et CDB ) Stratégies de la réparation de lésions radio-induites et tolérance des lésions Systèmes Activité Fidélité Réversion du dommage religation des CSB réparation fidèle Excision de bases dommages oxydatifs, CSB réparation fidèle Réparation des mésappariementsréparation des de bases erreurs réplicatives réparation fidèle Excision de nucléotides dimères Py-Py et adduits réparation fidèle Recombinaison homologue CDB, pontages,LMDS? réparation fidèle réparation infidèle Religation non homologue (NHEJ) CDB et LMDS réparation infidèle Synthèse translésionnelle, tolérance de la lésion ou Bypass (dommages de bases et adduits): ----> réparation fidèle ou infidèle ----> réparation fidèle ou infidèle dépendant de la lésion et de la polymérase impliquée ( ou )

92 1. Réversion directe de certaines cassures simples brin par une enzyme, la ligase I. 2. Réparation des bases mal appariées : élimination de ces bases et insertion de bases correctes par un processus multienzymatique. 3. Excision de bases modifiées et réparation des cassures simple brin (BER): - élimination par excision enzymatique des bases par des glycosylases et des endonucléases (Fpg, Nth,Nfo,Ape1, Ogg1) - réparation de sites abasiques - reconnaissance enzymatique (par la Poly(ADP-ribosyl) transférase, PARP) et réparation des cassures simple brin: après façonnage des brins, insertion de nucléotides corrects (1 à 5) et ligation des brins 4. Excision de nucléotides: système très spécialisé dans lexcision des lésions encombrantes (glycols de thymine, dimères etc.) peu souvent induites après irradiation ionisante. Systèmes de réparation des radiolésions (1) (voir Averbeck D. Cancer/Radiothérapie 2000;4:1-20)

93 Systèmes de réparation des radiolésions (2) 5. Réparation des cassures double brin (CDB) par recombinaison homologue: système fidèle nécessitant la présence de lADN homologue, donc dépendant de la phase du cycle cellulaire. La réparation implique (1) une reconnaissance des CDB par un complexe protéique (Mre11 Rad50,Nbs1) (2) une recherche dADN homologue (Rad51, Rad52) (3) un échange de brins dADN (4) une résolution des jonctions (résolvase, polymérase) (5) une ligation des brins par la ligase I 6. Réparation des cassures double brin (CDB) par religation non homologue: système de réparation souvent fautif car il implique une religation de brins endommagés après un façonnage. La réparation implique (1) une reconnaissance des CDB par des protéines (Ku70/80, DNA-PKcs) (2) un façonnage (3) une ligation des brins par des enzymes (XRCC4 and ligase IV)

94 Réparation des dommages radioinduits de l ADN ADN endommagé Radiations ionisantes Reconnaissance du dommage et signalisation ( ATM/ATR/PARP/p53/BRCA1/BRCA2 ) Réparation des mésappariements Excision de bases Excision de nucléotides Recombinaison homologue Religation non homologue Synthèse translésionnelle hREV3 hRAD30 hMLH1 hMSH2 hOGG1,hNTH HAP1, Pol, XRCC1 LIG3 XPA, B,C, D, XPE, F, G CSA, CSB hRAD50/ MRE11/NBS1 hRAD51 hRAD52 hRAD54 XRCC2 XRCC3 XRCC5 (KU86) XRCC6 (KU70) XRCC7 (DNA-PK) XRCC4 LIG4

95 Tolérance du dommage par synthèse translésionnelle (voir également: Lehmann AR, Exp. Cell Res. 2006;312: ) agent génotoxique (UV,RI) TT dommage de lADN blocage de la réplication normale de lADN synthèse translésionnelle Pol TT AAAC fidèlefautive Dr. D. Averbeck, Inst. Curie/CNRS UMR2027,Orsay

96 Quelques déficiences de la réparation de lADN chez lhomme

97 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints de syndromes d hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (1)

98 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints de syndromes d hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (2) Gènes CS (Cockayne) et TTD (trichothiodystrophie) - hypersensibilité aux rayons ultraviolets - affectent la réparation par excision de nucléotides - syndromes de transcription (les sous-unités du facteur de transcription TFIIH sont affectées) - absence de prédisposition pour les cancers de la peau Gènes MSH2 et MLH1 - affectent la réparation des mesappariements de bases - prédisposition pour le cancer non-polyposique du colon Gène BLM (syndrome de Bloom) - affecte l action hélicase (impliqué dans la réparation) - instabilité chromosomique et génétique

99 Certains gènes de réparation mutés chez les patients atteints de syndromes d hypersensibilité à divers agents génotoxiques prédisposent au cancer (3) Gène ATM (Ataxia telangectasia) (MF. Lavin et al. 1995, Bay et al. 2000) - hypersensibilité aux rayons gamma - affecte la réparation des CDB à faible débit de dose - affecte la progression dans le cycle cellulaire après irradiation gamma - affecte la phosphoinositidyl 3-kinase - prédispose aux cancers (leucémies et lymphomes) - en condition hétérozygote (prédisposition pour le développement de cancers du sein) Gène FANCC (Anémie de Fanconi) - hypersensibilité aux agents pontants - instabilité chromosomique - affecte la réparation des pontages intra -et interbrin

100 Réponses aux agents génotoxiques Activités cellulaires et agents chimiques endogènes Radiations ultraviolettes Agents chimiques Sites AP, CS, (CDB) dommages oxydatifs bases modifiées, erreurs replicatifs Sites AP,CSB,CDB, dommages oxydatifs, bases modifiées, LMDS, pontages PP dimères, bases modifiées pontages Adduits, cassures, pontages Dommages supportablesDommages excessifs Signalisation Arrêt du cycle Stress RéparationMutations Aberrations chrom. Voie de lapoptose Transformation Mort cellulaireSurvie cellulaire normale Rép. fautive Radiations ionisantes

101 DOMMAGES DE L ADN - MÉCANISMES DE RÉPARATION CONSÉQUENCES DES DOMMAGES

102 Ecole Doctorale de Cancérologie Master 2 de Physique Médicale PARIS XI ( ) RB1:Bases de la Radiobiologie et de la Radioprotection Responsables: J.M. COSSET-J. BOURHIS RB1.9 Lésions radio-induites de lADN: Mécanismes de réparation Inhibiteurs de la réparation Dr. Dietrich Averbeck Institut Curie-Section de Recherche Laboratoire Raymo,nd Latarjet Bâtiment 110 Centre Universitaire dOrsay F ORSAY Cedex Tél ;FAX: Cours le Jeudi 2 Novembre h00 à 12h30 Faculté Kremlin Bicêtre,63 rue Gabriel Péri,94276 Kremlin Bicêtre, Salle Pinel

103 Pourquoi sintéresse-t-on aux inhibiteurs de la réparation? Les radiations ionisantes, les agents chimiothérapeutiques et les rayons ultraviolets sont capables dempêcher la division cellulaire par linduction de lésions dans lADN. La radiothérapie et la chimiothérapie visent lélimination des cellules cancéreuses. Quelques tumeurs savèrent résistantes contre ces traitements à cause dune capacité de réparation plus élevée. Il est donc nécessaire dinhiber cette réparation. Il est important de mieux comprendre le mode daction de chaque système de réparation de lADN et les possibilités dinhibition afin daméliorer lefficacité des traitements anticancéreux.

104 Inhibition de la réparation de lADN est possible à différents niveaux (1) A. Apport des précurseurs nucléotidiques pour combler les brèches apparues pendant la réparation: -de mésapariements de bases après reconnaissance par des protéines MutS,MutL,PCNA etc. et excsion de la base mésappariée par EXO1 et dautres facteurs enzymatiques ----> puis synthèse par la polymérase delta + PCNA +RPA -par excision des dommages de bases (oxydées ou non) par des ADN glycosylases spécifiques et/ou des AP endonucléases ---> puis synthèse par la polymérase beta ou delta + PCNA + FEN -par excision de nucléotides par les endonucléases ERCC1/XPF et XPG ---> puis synthèse par les polymérases delta ou epsilon -par recombinaison homologue après reconnaissance et/ou façonnage du CDB par le complexe Rad50/Mre11/NBS1(Xrs2) avec lintervention de rad52 et rad > puis synthèse par une polymérase -par religation non homologue (NHEJ) après reconnaissance du CDB avec lintervention de Ku70/Ku80 et DNA-PKcs ----> puis synthèse par une polymérase

105 Inhibition de la réparation de lADN est possible à différents niveaux (2) B. Inhibition des enzymes impliquées dans la réparation de lADN: --Methyl transférase (O 6 -alkylguanine DNA méthyl transférase: inhibition par l O 6 - -Benzylguanine (essais cliniques en phase I sur patients atteints de lezucémies lymphoïdes chroniques). L O 6 -benzylguanine est particumièrement active en jonction avec des traitements par des alkylants nitorosourés comme le BCNU. -- Polymérases (alpha, beta) par laphidicoline et la didéoxythymidine (dThTTD) -- PARP-1 par le 3-aminobenzamide et dautres dérivés -- Protéine kinases (phosphoinositydil 3 kinases P3K): ATM, ATR et DNA-PKcs par la wortmannine, la caféine, etc.

106 Hydrolyse de liaisons N-glycosidiques

107

108 Cellules MCL-5 après Rayons gamma Formation de cassures (F.L. Martins et al. Mutat Res. 445(1999)21

109 Excision de nucléotides

110

111 Gemcitabine (2,2 -difluoro2 -désoxycytidine ou dFdC) (selon Pauwels B et al., The Oncologist 2005)

112 Différentes classes dinhibiteurs de la réparation de lADN (suite)

113 Rôle de la PARP-1 dans la réparation des CSB

114 Structure de la PARP (Jagtap P, Szabo C. Nature Rev Drug Discovery 4 May 2005: )

115

116 (Kim MY, Zhang T, Kraus WL Genes Dev 2005 ;19(17): )

117 Régulation et signalisation PARP-1 automodification, Catabolisme, NAD+ métabolisme Biologie moléculaire et cellulaire Détection des CSB de lADN et réparation Voie métabolique de lapoptose, Structure de la chromatine, Transcription Fonction dans la mitose Physiologie et Pathophysiologie Maintien du génome, Carcinogenèse, Vieillissement Réponses inflammatoires, Fonctions neuronales Rôles de la PARP

118 Inhibiteurs de la PARP ( selon Martin NMN, J PhotochemPhotobiol 2001;63: )

119

120 Religation non homologue (« non homologous end-joining » (NHEJ) (selon M. Christmann et al. Toxicology, 2003)

121 Inhibiteurs de phosphoinositydil 3 kinases

122

123 Wortmannin inhibits repair of DNA double-strand breaks in irradiated normal human cells (R. Okayasu et al. Radiat. Res. 149, (1998))

124 Différentes classes dinhibiteurs de la réparation de lADN (suite)

125 Mécanisme de linterférence ARN (Schwarz et al. Cell 2003;115: ) Pré-miRNA ARN double-brin (shRNA) siRNA synthétique Dicer ATP ADP + P Désappariements par lactivité Hélicase du Dicer Incorporation du brin guide dans le complexe RISC Dégradation du brin sens Répression de la traductionDégradation de lARNm ARNm AAA..A n Réduction de lexpression de gènes par lextinction spécifique dun gène cible

126

127 Différentes classes dinhibiteurs de la réparation de lADN (suite)


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