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LA PHOTOTRANSDUCTION Certificat « organes des sens » 2005-2006 S. ALLOUCHE.

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1 LA PHOTOTRANSDUCTION Certificat « organes des sens » S. ALLOUCHE

2 RAPPELS Lœil reçoit la lumière (entre par pupille, est focalisée sur rétine par cristallin) Il est capable de labsorber et de la transformer en énergie électrique (par lintermédiaire des cellules en cône et en bâtonnet de la rétine) Ce signal électrique est ensuite via le nerf optique transmis au cerveau qui reconstitue limage Ceci nécessite une coordination entre lœil et le cerveau

3 1.Emission de rayons lumineux à partir dun objet. Ces rayons sont focalisés sur la rétine et forme une image inversée 2.Sur la rétine, les cellules photoréceptrices qui absorbent la lumière sont alors activées 3. Les cellules photoréceptrices envoient alors un signal électrique via le nerf optique jusquau cerveau dans le cortex visuel 4.Ces signaux électriques reçus sont alors « décodés » et une image est alors reconstruite. 5.Il y a ensuite une interprétation de cette image reconstruite.

4 Comment se passe la transmission entre le signal lumineux et le signal électrique ? Cest au niveau des cellules photoréceptrices présentes dans la rétine que se fait cette transformation de signal lumineux en signal électrique La rétine Elle est constituée d'une fine membrane transparente qui tapisse toute la surface du fond de l'œil et contient les cellules photo-réceptrices (sauf au niveau de la tâche aveugle) Sa structure : il y a donc plusieurs niveaux de cellules. - une couche des cellules photo-réceptrices : les cellules en bâtonnet et les cellules en cône (nommées ainsi de part leur forme). - les neurones bipolaires constituent une nouvelle couche. En moyenne, 5 à 20 cellules visuelles sont en relation avec un neurone bipolaire - 5 à 10 neurones bipolaires sont en relation avec un neurone ganglionnaire (un million dans la rétine) dont les axones constituent les fibres du nerf optique La lumière doit dabord passer à travers les différentes couches de neurones avant datteindre les cellules photo-réceptrices

5 La rétine -lépithélium pigmenté (mélanine) a plusieurs rôles: 1.évite le reflet de la lumière vers les cellules photo-réceptrices 2.Apport de vitamine A

6 Les cellules photo-réceptrices

7 Il y en a environ 110 millions de cellules en bâtonnet dans la rétine humaine. Elles sont surtout présente dans la rétine périphérique et sont renferment la rhodopsine. Rôle dans vision « faible lumière » les cellules en cône sont au nombre de 6 millions et sont essentiellement présentes dans la fovéa (placée en position diamétralement opposée à la cornée transparente). Chez l'Homme, on a pu y mettre en évidence trois sortes de pigments, différents de la rhodopsine, mais sensibles aussi à la lumière. Rôle dans vision « colorée » Densité en photorécepteurs dans la rétine centrale cônes / mm 2 0 bâtonnets Densité en photorécepteurs dans la rétine périphérique 3000 à 4000 cônes / mm bâtonnets / mm 2 Diamètre d'un cône1,5 μm Diamètre d'un bâtonnet4 μm

8 Les cellules photo-réceptrices Dans la région de la fovéa, la liaison synaptique des photorécepteurs avec les bipolaires et les neurones ganglionnaires est approximativement linéaire: chaque cône fovéal dispose ainsi de sa "ligne privée" max. définition des images analysées par les photorécepteurs (le "grain rétinien") mais la luminosité doit être suffisante. La rétine centrale (fovéale) a donc une excellente acuité et une faible sensibilité = cest la vision centrale Dans la rétine périphérique, plusieurs cellules en bâtonnet convergent vers le même neurone ganglionnaire augmente la sensibilité (faible intensité lumineuse) mais faible résolution.

9 Les cônes, comme les bâtonnets comprennent deux parties: - le segment interne, contenant le noyau et les autres organites cellulaires. - le segment externe, de forme cylindrique est constitué par un empilement de replis membranaires qui portent les pigments photosensibles. La substance photosensible est constituée par le 11-cis rétinal + un récepteur couplé aux protéine G. C'est un dérivé de la vitamine A, ce qui explique qu'une carence en cette vitamine A (carottes, fruits, etc...) entraîne une diminution considérable de la sensibilité de l'œil aux faibles éclairements (cécité nocturne). Extrémité synaptique CôNE Cil connecteur Segment interne Segment externe Les cellules en cône

10 Les cellules à cône sont impliquées dans la vision des couleurs Alors quil nexiste quun type de cellule photo-réceptrice sensible à la vision monochromatique (cellules en bâtonnet), il y a 3 types différents de cellules à cône Ces cellules permettent la perception des 3 couleurs fondamentales : -Rouge -Bleu -Vert Le chromophore est identique pour ces 3 types de cellules, cest le 11-cis rétinal Ce chromophore est lié à des protéines différentes (la composition en AA du récepteur est quelque peu différente, présence dAA hydrophiles proches du 11-cis rétinal) donne des propriétés spectrales distinctes La photo-transduction à partir des cellules à cône est identique à celle des cellules à bâtonnet

11 Les cellules en cône

12 6 millions de cellules en cône impliquées dans la vision des couleurs et dans la forme des images vision diurne 110 millions de cellules en bâtonnet impliquées dans la vision monochrome (noir et blanc) mais extrêmement sensibles à la lumière vision nocturne Différence de réponse entre cellules en cône et cellules en bâtonnet : plus de sensibilité à la lumière pour cellules en bâtonnet (ex : lorsque lon passe dun endroit éclairé à un endroit sombre temps dadaptation) et photo-réponse plus rapide pour les cellules en cône La photo-tranduction : cest une cascade de réactions biochimiques qui se déroulent dans les cellules photo-réceptrices aboutissant à une impulsion électrique au niveau de la synapse terminale qui ensuite sera véhiculée par les autres cellules de la rétine, puis via le nerf optique jusque dans le cerveau ou le signal sera décodé.

13 Les cellules en bâtonnet Segment externe BATONNET Extrémité synaptique Cil connecteur Segment interne Structure : 1.Long et cylindrique 2.Un segment externe et un segment interne séparés par un cil connecteur 3.Dans le segment externe : empilement de disques plats membranaires contenant les photo-récepteurs, les canaux sodiques et calciques 4.Dans le segment interne : Na/K ATPase, mitochondries (ATP pour la Na/K ATPase), noyau 5.A lextrémité : le bouton synaptique Cellules capables de capter signaux lumineux dans bleu-vert ( = 500nm)

14 Les cellules en bâtonnet Zoom sur le segment externe

15 Les cellules en bâtonnet Formation des disques membranaires plats contenant les photo-récepteurs A partir du cil intermédiaire, formation des disques membranaires Renouvellement régulier par phagocytose niveau de lépithélium pigmenté

16 Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques Les cellules photo-réceptrices ont des propriétés électriques différentes des cellules nerveuses « classiques » : -leur potentiel de repos ~ - 30 mV (contre –60 à –90 mV) elles sont dépolarisées A lobscurité, elles vont libérer en continue leurs neurotransmetteurs à lextrémité synaptique (dont le glutamate) stimulation des autres cellules (bipolaires et ganglionnaires) Labsorption de lumière par les cellules photo-réceptrices va conduire à une hyperpolarisation avec un potentiel membranaire de – 35 mV « dark current »

17 Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques Cette hyperpolarisation sétend le long de la cellule photo-réceptrice vers lextrémité synaptique et inhibe la libération de neurotransmetteur Courants ioniques et dépolarisation / hyperpolarisation Ca 2+

18 Les cellules en bâtonnet : Propriétés électriques A lobscurité, le courant est lié à lentrée de Na + et de Ca 2+ par lintermédiaire de canaux présents sur le segment externe et à la sortie de K + au niveau du segment interne (mouvements dictés par gradient de concentration) Ce gradient ionique est maintenu grâce à la Na + / K + ATPase (3 sodium contre 2 potassium), échangeur Na + / Ca 2+, K + La présence de lumière va déclencher la fermeture de ces canaux ioniques et éviter laccumulation de charges positives à lintérieur des cellules photo-réceptrices La quantité de photon nécessaire au déclenchement de la fermeture des canaux ioniques peut être très faible : Un seul photon peut provoquer lhyperpolarisation d1 mV dans une cellule Il existe des mécanismes qui entre labsorption de la lumière et lhyperpolarisation vont permettre lamplification de ce signal : cest la photo-transduction

19 Les cellules en bâtonnet La rhodopsine ou le pigment visuel : Elle est composée : 1.Dune protéine qui est appelée opsine qui est composée de 7 domaines transmembranaires organisés en hélice alpha. C'est le premier RCPG à avoir été cloné, en 1984, et ce, chez l'homme. Depuis lors, l'ADNc de cette protéine a été cloné chez de nombreuses espèces animales (bovins). 2.Dun chromophore (cest une molécule qui va absorber la lumière à une certaine longueur donde) qui dans le cas de la rhodopsine est le 11-cis rétinal. Ce chromophore est lié de manière covalente à lopsine par lintermédiaire dune base de schiff. Le 11- cis rétinal provient du -carotène qui est métabolisé dans la muqueuse intestinale

20 Les cellules en bâtonnet Synthèse du 11-cis rétinal : -Sission par oxydation du -carotène - Transformation rétinal en 11-cis rétinal - Mise en réserve dans le foie sous la forme ester de vitamine A après réduction du rétinal en rétinol (ou vitamine A1) par la rétinol deshydrogénase. Après action dune estérase, la vitamine A se trouve complexée avec une molécule de palmitate. - Le rétinol sera ensuite acheminé jusquà par RBP via lépithélium pigmenté jusquaux récepteurs dans disques membranaires

21 11-cis rétinal Les cellules en bâtonnet 348 AA 39 kDa 2 chaînes Oligosaccharides extracellulaires

22 La rhodopsine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) un peu particulier, dans le sens où c'est un récepteur associé à son ligand. En effet, une molécule de 11- cis-rétinal est associée de manière covalente à un résidu de lysine du TM VII (296) de lopsine, et ce, par l'intermédiaire d'une base de Schiff. Ce rétinal est localisé dans la partie supérieure de la poche hydrophobe formée par les segments TM. La chaîne latérale d'un acide glutamique du TM III constitue le contre-ion qui stabilise le 11-cis-rétinal. Dautres résidus participent aux interactions : Gly 121 (TMIII), Phe 261 et Trp 265 (TM VI). Les cellules en bâtonnet

23 La liaison covalente du 11-cis rétinal sur lopsine contribue à maintenir le récepteur dans sa conformation inactive (mutant constitutivement actif quand Lys296 Gly) Dautre part, les régions extracellulaires sont « rigides » et cela va réduire lactivation spontanée du récepteur en absence de lumière intérieur extérieur Vue côté cytoplasmique

24 Les cellules en bâtonnet Propriétés physico-chimiques du 11-cis rétinal : Ce chromophore est donc capable dabsorber les photons de la lumière. Le maximum dabsorbance est obtenu à 380 nm lorsquil est à létat libre et lorsquil est fixé sur lospine, ce maximum est denviron 500 nm pour les bovins et de 560 nm pour lhomme.

25 Les cellules en bâtonnet Lorsque le 11-cis rétinal absorbe les photons, il se produit alors une isomérisation avec le passage à la forme tout-trans rétinal (les électrons vont aller sur des orbitales de plus haute énergie, cela va « casser » la double liaison entre les carbones C11 et 12 du 11-cis rétinal et permettre une libre rotation et lobtention du tout-trans rétinal). Lisomérisation ne se produit pas spontanément mais grâce à labsorption de photons mais pas systématiquement. Cette étape est très rapide < quelques picosecondes ( sec) Cette isomérisation du chromophore déclenche à son tour lhydrolyse de la base de schiff entre lopsine et le rétinal. La forme tout-trans rétinal est alors libérée. Le récepteur va alors passer dans une conformation active et initier une cascade de réactions biochimiques conduisant à la transmission dun signal électrique

26 Les cellules en bâtonnet Isomérisation du 11-cis rétinal en tout-trans rétinal Liaison sur la Lys296 de lopsine

27 Les cellules en bâtonnet Etats intermédiaires entre la rhodopsine inactive (11-cis rétinal) et lopsine sous forme libre : Ces différents états ont été mis en évidence à basses températures et possèdent des propriétés spectrales distinctes. Citons la bathorhodopsine qui contient le tout-trans rétinal. Parmi ces intermédiaires, seule la métarhodopsine II est la forme active pour la transmission du signal

28 R* Les cellules en bâtonnet

29 rhodopsinebathorhodopsine

30 TRANSDUCINE La metarhodopsine II qui correspond à létat activé du récepteur (R*) va stimuler des protéines G qui ne sont uniquement exprimées dans les cellules photo-réceptrices : les transducines.

31 Dans la membrane des disques présents dans le segment externe, les récepteurs activés sont mobiles et une molécule de récepteur est capable dactiver environ une centaine de molécules de transducine : cest une étape damplification du signal. Les transducines sont composées de 3 sous-unités : T, T et T. Au repos, la transducine existe sous létat hétérotrimérique. Linteraction métarhodopsine II (2ème et 3 ème boucle intracellulaire) avec T, va catalyser la libération du GDP en permettant un changement de conformation et louverture de la « poche de liaison des nucléotides guanyliques ». Des études par mutagénèse dirigée ont montré que le pont disulfure formé par les Cys 110 et 187 liant le TM III et la 2ème boucle intracellulaire était indispensable à lactivation de la protéine G. Cette interaction fait également intervenir lextrémité carboxy-terminale du récepteur avec lextrémité carboxy-terminale de la sous-unités Il en résulte la fixation du GTP sur T, qui a son tour provoque la dissociation de lhétérotrimère en T et. T -GTP se dissocie de R* et va activer la GMPc-phosphodiestérase TRANSDUCINE

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34 Guanylate cyclase et GMPc La guanylate cyclase est lenzyme qui permet la production de GMPc à partir du GTP Cest une protéine oligomérique intégrale de la membrane plasmique Lors dun flash lumineux, la concentration en calcium chute de 500 à 100 nM dans la cellule photo-réceptrice : ceci est due à la fermeture des canaux Na + / Ca 2+ GMPc- dépendant et à la [GMPc] via la phosphodiestérase Cest une protéine dont lactivité est régulée par le calcium via des protéines : GCAP1 et 2. Lorsque les concentrations cytosoliques de calcium diminuent de 500 et 100 nM, lactivité de cet enzyme est multipliée par Ceci stimule la guanylate cyclase qui [GMPc] Il se produit alors une ré-ouverture des canaux ionique et une augmentation des concentrations en calcium. Lactivité de la guanylate cyclase est alors réduite

35 Guanylate cyclase et GMPc

36 GMPc-PHOSPHODIESTERASE A lobscurité, on retrouve une forte concentration de GMPc dans le segment externe des cellules en bâtonnet. Ce composé contrôle louverture des canaux ioniques (Na + et Ca 2+ qui rentrent dans la cellule et produisent une dépolarisation des membranes) en se fixant directement dessus extérieur intérieur

37 GMPc-PHOSPHODIESTERASE PDE La GMPc phosphodiestérase (PDE) est une protéine membranaire composée de 4 sous-unités : -2 sous-unités catalytiques et -2 sous-unités inhibitrices identiques A lobscurité, la PDE se trouve à létat dhétérotétramère inactif. En présence de lumière, une molécule de transducine activée (T -GTP) va pouvoir se complexer aux sous-unités, libérant ainsi les 2 sous-unités catalytiques et (activation dune molécule de PDE) la PDE peut hydrolyser plus de 1000 molécules de GMPc / sec

38 GMPc-PHOSPHODIESTERASE La PDE en abaissant le taux de GMPc cytosolique va provoquer une fermeture des canaux ioniques. Lorsque les canaux ioniques sont fermés, il se produit une hyperpolarisation des membranes. Lorsque les canaux ioniques sont ouverts, il y a dépolarisation Cest lalternance dépolarisation / hyperpolarisation qui provoque le signal électrique décodé par le cerveau

39 Régulation du signal : La transducine Suite à la stimulation par la lumière, le système doit revenir dans son état initial : Cest ladaptation visuelle Il existe de nombreux mécanismes de régulation dont le premier se déroule sur la transducine T -GTP 1.Hydrolyse de GTP en GDP par lactivité GTPasique intrinsèque In vitro, cette activité GTPasique est trop faible pour rendre compte de la vitesse rapide dinactivation. Deux autres protéines interviennent de manière coordonnée pour accélérer cette activité : -PDE -RGS 9 (regulatory G-protein signaling)

40 Régulation du signal : La guanylate cyclase (GC) 2. Lactivité de la GC est régulée par le calcium intracellulaire : - A lobscurité, 500 nM calcium intracellulaire et par lintermédiaire de protéines qui forment des complexes avec le calcium inhibition de la guanylate cyclase (fixation directe sur la GC par les protéine calmoduline-like) - Après activation de la rhodopsine, fermeture des canaux ioniques et les concentrations cytosoliques de calcium diminuent à 100 nM levée de linhibition et augmentation de lactivité de cet enzyme

41 Régulation du signal 1 3 GMPc GMP GTP GC 2

42 Régulation du signal : Phosphorylation du récepteur 3. Les cascades biochimiques de la photo-transduction sont enfin terminées par la phosphorylation de la rhodopsine Le récepteur activé R* repasse ainsi sous sa conformation inactive R La phosphorylation est réalisée par la rhodopsine kinase (RK) ou GRK1 (G-protein receptor kinase) qui permet ensuite au récepteur phosphorylé dinteragir avec une autre protéine larrestine Ces mécanismes sont similaires à ceux décrits pour la désensibilisation de la super-famille des récepteurs couplés aux protéines G

43 Régulation du signal : Phosphorylation du récepteur Premières données sur phosphorylation rhodopsine après flash lumineux datent des années 1970 Caractérisation de la RK en 1988 par analogie entre la phosphorylation du récepteur 2-adrénergique par la ark et celle de la rhodopsine Clonage de ces GRK et classification selon leur homologie de séquence : La Rhodopsine Kinase (RK) ou GRK1 et la GRK7 ou « cone opsin kinase » appartiennent au groupe 1 Expression de la GRK1 et de la GRK7 à la fois dans les cellules en bâtonnet et en cône

44 GRK et phosphorylation du récepteur

45 Mécanisme dactivation de la RK par R* (modèle) : 1.Présence de la RK à létat inactif 2.Activation de la rhodopsine par un flash lumineux R R* 3.Formation dun complexe stable R*(état métarhodopsine)-RK et activation de la kinase : rôle des 2 ème et 3 ème boucles intracellulaires dans linteraction et lactivation de la RK 4.Proximité domaine catalytique de la RK et des sites des phosphorylation (dans lextrémité carboxy-terminale) 5.La RK pourrait ensuite aller phosphoryler dautres rhodopsines inactives par diffusion

46 GRK et phosphorylation du récepteur

47 In vitro, 1 molécule de rhodopsine peut être phosphorylée jusquà 9 résidus par la RK Il existe 3 sites majeurs de phosphorylation : Ser 334, Ser 338 et Ser 343 In vivo, phosphorylation en premier sur Ser 343 et Ser 338 puis Ser 334 Il semblerait que plus il y a de phosphorylation (au moins 3), plus le récepteur est inactivé Conséquences des phosphorylation : 1.Réduction du couplage aux transducines 2.Formation dun complexe R*-P avec larrestine (compétition avec T )

48 Régénération Régénération : elle se produit à lobscurité et va consister en : 1. La déphosphorylation de lopsine par des phosphatases 2. Isomérisation du tout-trans rétinal en 11-cis rétinal + combinaison avec lopsine (cycle court) 3. Lorsque la stimulation est intense, réduction du tout-trans rétinal en tout-trans rétinol par une deshydrogénase présente dans le segment externe (cycle long) Cette forme réduite est alors transportée vers lépithélium pigmentaire où se trouve une rétinol isomérase et permet le passage tout-trans rétinol 11-cis rétinol. Action dune alcool deshydrogénase pour transformer le 11-cis rétinol 11-cis rétinal. Le chromophore va alors pouvoir se complexer de nouveau à lopsine pour reformer la rhodopsine.

49 Recomposition rapide Passage dans la circulation Rhodopsine h Rétinal "cis" + opsine Rétinol "cis" Cycle court Rétinal "trans" + opsine Rétinol "trans" Cycle long Régénération

50 Résumé

51 Pathologies Il existe de nombreuses maladies héréditaires humaines touchant la rétine dont la rétinite pigmentaire (groupe très hétérogène) : cela se traduit par une dégénérescence de la rétine ou une cécité nocturne La photo-transduction implique plusieurs protéines plusieurs gènes mais identification danomalies dans les gènes suivants : 1.Rhodopsine 2.PDE (sous-unités et ) 3.GC 4.RK 5.Transducine 6.Arrestine

52 1.Mutations de la Rhodopsine 30-40% cas de rétinite pigmentaire (cécité autosomique dominante) sont causés par mutations faux-sens ou des décalage du cadre de lecture dans le gène de la rhodopsine. La mutation Pro23 His (cause une dégénérescence rétinienne) est la plus fréquente mais + de 100 mutations décrites. Les mutations dans les régions extracellulaires empêchent stabilisation de la forme de lopsine capable de lier le chromophore. Les mutations dans la région C terminale empêchent une exportation correcte des récepteurs synthétisés Les mutations dans les domaines TM conduisent à un récepteur constitutivement actif (phosphorylé et bloqué par larrestine) Pathologies

53 2. Maladie dOguchi Cest une maladie autosomique récessive qui est responsable dune cécité nocturne Larrestine ou la RK peuvent être mutées Mutation de larrestine décrite en 1995 chez un patient dorigine japonaise. La mutation non-sens conduit à lapparition dune protéine tronquée Mutations dans la RK (délétion, faux-sens) conduisent à une protéine avec une activité kinasique déficiente. Dans ce cas, la cascade de photo-transduction est normale mais la phase de régénération est très ralentie.

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